Гельминтологические методы исследований . Методы диагностики гельминтозов разделяют на прямые, основанные на непосредственном выявлении самих гельминтов или их фрагментов, а также личинок и яиц гельминтов (методы исследования фекалий, мочи, желчи и дуоденального содержимого, мокроты, крови и тканей, материала, полученного при соскобе из перианальной области и подногтевых пространств), и косвенные, с помощью которых выявляют вторичные изменения, возникающие в организме человека в результате жизнедеятельности гельминтов (исследования морфологического состава крови, иммунологические методы диагностики гельминтозов, рентгенологические исследования и т.д.). Из прямых методов наиболее распространены копрологические, которые делятся на макро- и микрогельминтоскопические. В отдельных случаях используют специальные методы.
Макрогельмитоскопические методы исследования направлены на поиски гельминтов или их фрагментов (сколексов, члеников, частей стробилы цестод). Их применяют для диагностики тех гельминтозов, при которых яйца не выделяются с экскрементами больного или выделяются в небольшом количестве и не всегда (например, при энтеробиозе в фекалиях обнаруживают острицы, при тениидозах - членики).
Для обнаружения в фекалиях остриц или члеников цестод проводят просмотр фекалий невооруженным глазом. Для дифференциальной диагностики тениидозов рекомендуется просмотр разжиженных водой фекалий отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или в чашках Петри на темном фоне. Крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривают под лупой между двумя предметными стеклами. Если же по клиническим показаниям предполагают обнаружение мелких гельминтов или головок цестод после лечения, то подозрительные частицы рассматривают под лупой в капле глицерина, а в случае необходимости и под микроскопом.
Микрогельминтоскопические методы исследования (качественные) направлены на выявление яиц и личинок гельминтов. Применяют метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като. Смесь Като состоит из 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл 6% раствора фенола. Пластинки по Като (гидрофильный целлофан разрезают на части размером 20´ 40 мм ) погружают на 24 ч в смесь Като так, чтобы они прилегали друг к другу (3-5 мл раствора Като на 100 пластинок). 100 мг фекалий наносят на предметное стекло, накрывают целлофановой покровной пластинкой по Като и придавливают так, чтобы фекалии размазались по предметному стеклу в пределах целлофановой пластинки. Мазок оставляют при комнатной температуре для осветления на 40-50 мин, после чего просматривают под микроскопом. В жаркое время года во избежание высыхания препарата на пластинку приготовленного препарата кладут влажную губку.
Для полного выявления гельминтов всех видов метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като необходимо использовать в сочетании с одним из методов обогащения. Наиболее распространенными из них являются метод Калантарян и метод Фюллеборна.
Метод Калантарян: в склянках с широким горлом объемом 100 мл тщательно размешивают стеклянной палочкой 5 г фекалий, постепенно доливая насыщенный раствор нитрата натрия (1 кг азотнокислого натрия на 1 л воды при кипячении) до краев стакана. Всплывшие на поверхность крупные частицы удаляют бумажным совочком. К поверхности солевого раствора прикладывают предметное стекло (солевой раствор добавляют до полного соприкосновения смеси с предметньм стеклом). Через 20-30 мин предметное стекло снимают и пленку просматривают под микроскопом. При отсутствии данной соли можно использовать насыщенный раствор поваренной соли по Фголлеборну (400 г соли в 1 л воды при кипячении).
В связи с тем, что яйца, имеющие большой удельный вес (неоплодотворенные яйца аскарид, яйца трематод и крупных цестод), не всплывают, помимо исследования поверхностного слоя жидкости, при использовании метода Фюллеборна необходимо просмотреть под микроскопом 2-4 препарата из осадка.
Специальные лабораторные методы исследований на различные гельминтозы.
Простые методы
Макроскопический метод. При осмотре фекалий можно обнаружить гельминтов, их головки, членики, обрывки стробилы, выделяющиеся самостоятельно или после дегельминтизации. Этот метод особенно рекомендуется для выявления энтеробиоза, тениоза и тениаринхоза.
Небольшие порции кала перемешивают с водой в плоской ванночке или в чашке Петри и, просматривая при хорошем освещении на темном фоне, при необходимости пользуясь лупой, извлекают гельминтов и все подозрительные образования белого цвета пинцетом или пипеткой. Собранное переносят в другую чашку с водой или на предметное стекло в каплю разведенного глицерина или изотонического раствора хлорида натрия для дальнейшего изучения.
При методе отстаивания всю исследуемую порцию фекалий следует размешать с водой в стеклянном цилиндре, затем осторожно слить верхний слой воды. Так повторяют несколько раз. Когда жидкость станет прозрачной, ее сливают, а осадок просматривают небольшими порциями в стеклянной ванночке или чашке Петри, как было указано выше.
Микроскопические методы - основной способ исследования фекалий для обнаружения яиц или личинок гельминтов. Различные методы исследования описаны ниже. С целью повышения достоверности обследования анализы могут быть повторены несколько раз ежедневно или с промежутком в 1-3 дня.
Метод нативного мазка. Нативный мазок - наиболее распространенный и технически доступный метод исследования фекалий. В нативном мазке можно обнаружить яйца и личинки гельминтов всех видов. Однако при небольшом числе яиц в испражнениях их не всегда удается найти. Поэтому исследование кала только при помощи нативного мазка не является полноценным и должно дополняться методами обогащения. Эффективность исследования нативного мазка заметно повышается при просмотре четырех препаратов, приготовленных из пробы кала на двух предметных стеклах без покрытия покровными стеклами, что позволяет исследовать в общей сложности примерно такое же количество кала, как и по методу Като (см. ниже).
Небольшое количество (величиной со спичечную головку) размешанного кала тонко размазывают деревянной палочкой на поверхности предметного стекла в капле 50%-го раствора глицерина. Обычно на одном стекле готовят два мазка. Мазок просматривают под малым увеличением микроскопа (об. 8, ок. 7). В сомнительных случаях его накрывают покровным стеклом и исследуют под большим увеличением (об. 40).
Для приготовления большого нативного мазка 200-300 мг кала (размером с крупную горошину) растирают на стекле размером 6х9 см в 15-20 каплях 50%-го водного раствора глицерина. Просматривают под бинокулярным стереоскопическим микроскопом (об. 4, ок. 12,5 или об. 2, ок. 17) в проходящем свете без покровных стекол. В сомнительных случаях можно переводить объектив на большее увеличение. В таких мазках хорошо видны окрашенные крупные яйца гельминтов, несколько хуже - прозрачные яйца карликового цепня. Для обнаружения мелких яиц этот метод непригоден. Вместе с тем большой объем исследуемого материала и большое поле зрения при высокой глубине резкости обеспечивают значительную эффективность указанной модификации по сравнению с обычным нативным мазком.
Толстый мазок с целлофаном (метод Като) более эффективен, чем изучение нативного мазка, но также требует сочетания с методами обогащения. Выявляются яйца всех видов гельминтов, однако с целью обнаружения яиц карликового цепня (яйца прозрачные) или описторха (мелкие яйца) лаборант должен быть особо внимательным, чтобы их не пропустить (рис.21).
Метод основан на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Предварительно гидрофильный целлофан нарезают пластинками размером 20 х 40 мм и погружают в смесь Като (6 мл 3%-го водного раствора малахитового зеленого, 500 мл глицерина, 500 мл 6%-го раствора фенола). 3-5 мл смеси хватает на 100 пластинок, которые готовы к использованию через сутки и могут храниться в этой же смеси в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре в течение 6 мес. При отсутствии малахитового зеленого (рекомендуется для уменьшения утомляемости глаз лаборанта) и фенола (дезинфицирующее средство) можно пользоваться только 50%-м водным раствором глицерина, эффективность исследования не снижается.
Рис. 20. Методика приготовления толстого мазка кала с целлофаном по Като
100 мг испражнений наносят на предметное стекло, покрывают обработанной, как указано выше, пластинкой целлофана и придавливают резиновой пробкой так, чтобы испражнения не растекались из-под целлофана. Микроскопирование при малом или большом увеличении микроскопа проводят не позже, чем через 1 час (в жаркую погоду - 30-40 мин) после приготовления мазка. Причиной непрозрачности препарата могут быть толстый слой фекалий, плохая обработка пластинки в смеси Като, недостаточный срок выдержки препарата под целлофаном. Длительное просветление глицерином и чрезмерное высыхание препарата также затрудняют обнаружение яиц.
Метод закручивания по С.С. Шульману. Метод предложен для обнаружения в кале личинок гельминтов, в первую очередь стронгилоида. Исследуют только свежевыделенные фекалии, 2-3 г которых переносят в стеклянную банку, размешивают стеклянной палочкой круговыми движениями с 3-5-кратным количеством физиологического раствора, не касаясь стенок сосуда. Яйца и личинки гельминтов скапливаются в центре. После окончания перемешивания каплю на конце палочки быстро переносят на предметное стекло, закрывают ее покровным стеклом и исследуют под микроскопом.
Методы обогащения. Методы обогащения основаны на разности удельного веса яиц и применяемого солевого раствора, что позволяет обнаружить их небольшое количество. Если удельный вес яиц больше удельного веса жидкости, то яйца концентрируются в осадке, который исследуют под микроскопом. Этот метод седиментации (осаждения) применяют для яиц трематод. При большем удельном весе раствора яйца всплывают на поверхность жидкости, и тогда исследуют пленку. Это методы флотации (всплывания), они наиболее эффективны для обнаружения яиц анкилостомид, власоглава и карликового цепня.
Методы флотации. Метод Фюллеборна основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия, имеющем высокую относительную плотность (1,2), что дает возможность выявления яиц при небольшом их количестве. Метод более эффективен, чем изучение нативного мазка, хотя и сложнее. Достоинствами метода являются дешевизна и доступность. Рекомендуется сочетать изучение нативного мазка и метода Фюллеборна.
Насыщенный раствор готовят, растворяя 400 г хлорида натрия в 1 л воды при кипячении. Относительная плотность раствора 1,18-1,22. Раствор хранят в закрытой бутыли. Для проведения анализа в банку объемом 30-50 мл помещают 2-3 г испражнений и при помешивании палочкой доливают почти доверху насыщенный раствор хлорида натрия. Полоской бумаги быстро удаляют всплывшие крупные частицы. Через 45-60 мин. отстаивания проволочной петлей снимают поверхностную пленку и переносят ее на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина. Вместо снятия пленки петлей можно долить раствор в банке доверху, накрыть предметным стеклом, к поверхности которого пристают всплывшие яйца. Готовят несколько препаратов. Дополнительно просматривают 2-4 препарата из осадка, набирая его глазной пипеткой на 2 предметных стекла. Помимо поверхностной пленки, необходимо обязательно исследовать также и осадок, поскольку яйца трематод, тениид, неоплодотворенные яйца аскарид не всплывают в данном растворе. Яйца ряда гельминтов всплывают в соленом растворе не сразу. Так, если максимальное число яиц карликового цепня всплывает через 15-20 мин, то аскарид - через 1,5-2 ч, власоглава - через 2-3 ч.
Таким образом, к достоинствам этого метода относится его дешевизна и доступность, к недостаткам - необходимость просмотра препаратов на поверхностной пленки и осадка, а также длительность отстаивания.
Метод Е. В. Калантарян также является методом обогащения, но более эффективен и проще, чем метод Фюллеборна. Применяется насыщенный раствор нитрата натрия с относительной плотностью 1,38. Поэтому яйца большинства гельминтов всплывают и обнаруживаются в поверхностной пленке, исследование осадка не требуется.
Для приготовления насыщенного раствора нитрата натрия 1 кг соли нитрата натрия (натриевой селитры) растворяют в 1 л воды и кипятят до полного растворения и образования на поверхности пленки. Без фильтрования переливают в сухую бутыль. При отсутствии нитрата натрия его можно заменить нитратом аммония (аммиачная селитра), растворяя 1,7 кг на 1 л воды. Относительная плотность полученного раствора 1,3, что несколько снижает эффективность по сравнению с раствором нитрата натрия.
Достоинства метода: быстро всплывают и обнаруживаются в поверхностной пленке яйца большинства гельминтов, что исключает необходимость исследования осадка. Недостатками метода являются дефицит нитрата натрия, а также то, что яйца трематод, онкосферы тениид не всплывают и остаются в осадке. Необходимо учитывать, что при длительном (более 1 -2 ч) выдерживании фекалий в растворе яйца некоторых гельминтов начинают набухать и оседают, исчезая из поверхностной пленки.
Методы седиментации
Метод П. П. Горячева основан на принципе осаждения яиц. Мазок в этом случае получается светлый, без грубой примеси, что облегчает обнаружение мелких яиц трематод (описторха и др.). Удельный вес яиц описторха высок, поэтому они не всплывают в солевых растворах.
В цилиндр диаметром 2-3 см наливают 70-100 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Отдельно тщательно размешивают 0,5 г испражнений в 20-25 мл воды и осторожно фильтруют через воронку с двумя слоями марли в цилиндр на солевой раствор, избегая перемешивания (так, чтобы образовалось два четко разграниченных слоя). Через 2-3 часа верхний слой с калом отсасывают пипеткой, а оставшийся солевой раствор оставляют стоять на 12-20 часов или центрифугируют. Осадок пипеткой переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Метод Горячева был предложен для обнаружения яиц описторха и оказался эффективнее, чем исследование нативного мазка и метод Фюллеборна. В настоящее время для диагностики описторхоза (клонорхоза) рекомендуют методы Като и Калантарян, как достаточно эффективные и технически более простые.
Метод Красильникова. Под действием поверхностно-активных веществ, входящих в состав моющих средств (детергентов), яйца гельминтов освобождаются от испражнений и концентрируются в осадке.
Предварительно готовят 1%-й раствор стирального порошка «Лотос». Для этого 10 г порошка растворяют в 1 л водопроводной воды. При отсутствии «Лотоса» можно использовать и другие стиральные порошки, но каждого из них нужно брать столько, сколько растворится без образования осадка в 1 л водопроводной воды. В стеклянный сосуд емкостью 30-50 мл наливают 20-30 мл раствора детергента, туда же помещают небольшую порцию испражнений и хорошо перемешивают. Соотношение испражнений и раствора должно быть примерно 1:20. Испражнения должны находиться в растворе не менее суток. За это время на дне образуется осадок из 2-3-х слоев. Нижний слой состоит из грубых тяжелых частиц, в среднем слое собираются яйца гельминтов, верхний слой представляет собой беловато-серые хлопья. Затем пипеткой набирают 2-3 капли жидкости из среднего слоя и переносят на предметное стекло. На одном стекле готовят 2 препарата, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Метод Красильникова позволяет обнаружить яйца всех видов гельминтов, выделяемые с испражнениями.
Эфир-формалиновый метод седиментации и химикоседиментационный метод при высокой эффективности весьма трудоемки, особенно при массовых обследованиях, в связи с этим целесообразнее использовать эфир-уксусный метод. Он позволяет после дополнительной обработки осадка химреактивами получить в нем практически только яйца гельминтов, что облегчает выявление мелких яиц трематод. Этот метод оказался универсальным, выявляющим яйца всех кишечных гельминтов, цисты кишечных простейших, он также может использоваться для количественной оценки интенсивности инвазии.
В центрифужные градуированные пробирки наливают 7 мл 10%-го раствора уксусной кислоты и добавляют 1 г фекалий до отметки 8 мл. Фекалий и тщательно перемешивают палочкой до образования однородной смеси, а затем процеживают через два слоя марли в другую центрифужную пробирку (чтобы в новой пробирке процеженного раствора снова было 8 мл, если меньше, то дополнительно можно ополоснуть 10% раствором уксусной кислоты воронку с бинтом, через которые процеживали раствор фекалий). В эту пробирку добавляют 2 мл эфира (до метки 10 мл), закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 30 сек. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 минуты (или 2 минуты при 1500 об/мин). Слой коагулянта (в виде пробки в верхней части пробирки) палочкой отделяют от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью осторожно сливают. Осадок (как правило, небольшой, бесцветный) наносят на предметные стекла пипеткой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Испражнения исследуются двумя методами:
1. Макроскопический – обнаруживают гельминтов, их головки, членики, обрывки стробилы. Небольшие порции кала, перемешивают с водой в плоской ванночке или чашке Петри и просматривают при хорошем освещении на темном фоне, при необходимости пользуясь лупой. Все подозрительные образования пинцетом переносят в другую чашку с водой или на предметное стекло в каплю разведенного глицерина.
При методе отстаивания исследуемую порцию фекалий размешивают с водой в стеклянном цилиндре, после отстаивания сливают верхний слой воды. Так повторяют несколько раз. Когда жидкость станет прозрачной, ее сливают, а осадок просматривают в чашке Петри.
2. Микроскопический – для обнаружения яиц и личинок гельминтов. Существует много методов исследования.
Нативный мазок – наиболее распространенный и технически доступный метод исследования. Можно обнаружить яйца и личинки всех гельминтов. Однако, при небольшом количестве яиц их не всегда удается найти. Поэтому используется метод обогащения.
1. Метод Фюллеборга – это метод обогащения, основан на всплытии яиц гельминтозов в насыщенном растворе NaCl (1,2 – плотность; 400 г NaCl на 1 литр воды; 40% раствор NaCl). Метод более эффективен, чем нативный мазок. В стеклянные банки помещают 2-5 г фекалий и заливают раствором NaCl, размешивают и через 45 минут снимают образовавшуюся пленку металлической петлей, помещают каплю глицерина на предметное стекло. Исследуют под микроскопом. Недостаток метода – замедленное высплывание яиц различных гельминтов, карликовый цепень – через15-20 минут, аскарид – 1,5 часа, власоглав – 2-3 часа.
2. Метод Калантарян – также метод обогащения, но применяется насыщенный раствор NaNO 3 (1,38 плотность). Большинство яиц всплывает, не требуется исследования осадка. Недостаток – длительное выдерживание яиц в растворе, приводит к тому, что некоторые яйца начинают набухать и оседать на дно, исчезая с поверхностной пленки.
3. Метод Горячева – основан на принципе осаждения яиц, обнаружения мелких яиц трематод. В качестве раствора используют насыщенный раствор NaCl и сверху осторожно наслаивают 3-4 мл раствора фекалий. Через 15-20 часов яйца трематод оседают на дно. Жидкость сливают, осадок на предметное стекло и под микроскоп.
4. Метод закручивания по Шульману – для обнаружения в кале личинок гельминтов. Исследуют только свежевыделенные фекалии. 2-3 г помещают в стеклянную банку и приливают 5-кратное количество воды, быстро размешивают палочкой, не касаясь стенок банки – 20-30 минут, затем палочку быстро вынимают, и каплю жидкости на конце переносят на предметное стекло и микроскопируют.
5. Метод Бермана – основан на способности, личинок гельминтов мигрировать, по направлению к теплу, и служит для выявления их в фекалиях.
6. Метод Харада и Мори (метод выращивания личинок) и рекомендуется для исследования на анкилостомитозы. Метод основан на том, что в тепле и на влажной фильтрованной бумаге из яиц анкилостомид развиваются филяриевидные личинки, которые легко можно обнаружить. На середину полоски фильтрованной бумаги наносят 15 г кала, бумагу с фекалиями помещают в банку, так, чтобы нижний конец был погружен в воду, а верхний закреплен пробкой. Банку выдерживают в термостате 28 0 С в течение 5-6 дней. Филяриевидные личинки развиваются за это время и спускаются в воду. Жидкость исследуют под лупой. Если трудно обнаружить, жидкость центрифугируют, убив предварительно личинок нагреванием до 60 0 . Лаборант должен работать в перчатках.
7. Методы на энтеробиоз – выявление яиц острицы и бычьего цепня.
а) соскоб с перианальных складок – ватным тампоном, туго намотанным на деревянную палочку и смоченную 50% раствором глицерина. В лаборатории тампон смывают 1-2 каплями 50% водным раствором глицерина.
б) метод липкой лепты (метод Грэхэма)
Липкую ленту прикладывают к перианальным складкам, затем липким слоем к предметному стеклу и микроскопируют.
в) соскоб с помощью глазных палочек (метод Рабиновича). Для перианального соскоба используют стеклянные глазные палочки, широкая часть которых покрывается специальным клеем, что позволяет удерживать яйца остриц.
Исследование крови, желчи, мокроты и мышц
Микроскопия крови – обнаруживают личинки филярий.
Исследование мокроты – яйца параганима, личинки аскариды, некатора, стронгилоида, элементы эхинококкового пузыря.
Исследование мышц – при подозрении на трихинеллез исследуют мышцы больного или трупа, а также мясо, предположительно послужившего причиной заражения человека. С целью трихинеллоскопии мышцу разрезают на мелкие кусочки и помещают в компрессорий, это два широких, толстых стекла, которые раздавливают мышцы и личинки трихинеллы обнаруживаются в виде капсул – метод компрессии.
Метод переваривания – мышцы заливают искусственным желудочным соком (раствор соляной кислоты и пепсин). Мышцы перевариваются, а личинки легко выявляются. Определение интенсивности инвазии: количество личинок до 200 на 1 г мышечной ткани – умеренная интенсивность инвазии; до 500 – интенсивная; свыше 500 – сверхинтенсивная инвазия.
Серологические методы
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕЛЬМИНТОЗОВ
Строение члеников ленточных гельминтов изучают, помещая их между двумя предметными стеклами. Членики бычьего цепня крупнее члеников свиного и лентеца широкого, они имеют больше боковых маточных ответвлений, чем у свиного цепня, - около 30 (против 7-10) (рис. 14, 15).
Членики широкого лентеца короткие, широкие и имеют в центре розетковидное выпячивание - матку (рис. 16).
Подвижны только членики бычьего цепня.
Головка каждого из цестод отличается некоторыми особенностями. Головка свиного солитера снабжена четырьмя присосками и хоботком с двумя рядами крючьев (вооруженный цепень). На головке бычьего цепня крючья отсутствуют (невооруженный цепень). Головка широкого лентеца имеет по бокам две ботрии - щели, с помощью которых широкий лентец прикрепляется к слизистой оболочке кишки (рис. 17, 18, 19).
Для выявления гельминтов исследуют испражнения, перианальную и ректальную слизь, дуоденальное содержимое, мокроту, кровь и частицы тканей. Важное значение в микрогельминтологических исследованиях имеет овоскопия, которая дает возможность поставить диагноз по форме яиц при микроскопии препаратов из кала, желчи. Некоторые гельминты локализуются вне кишок (цистицерк, трихинеллы, эхинококк). В этих случаях для диагностики используют иммунологические методы исследования, биопсию и др.
При микроскопии необходимо брать свежие испражнения либо консервировать их в 5% растворе формалина во избежание высыхания кала, при котором изменяется форма яиц и затрудняется правильная диагностика.
Исследуют их микроскопией нативного мазка, после обогащения - методом Фюллеборна, Телеманна и др.
Для приготовления нативного препарата небольшую часть фекалий берут из разных участков доставленной порции, тщательно растирают на предметном стекле в капле физиологического раствора хлорида натрия или 50% раствора глицерина. Препарат накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом (не менее 2 препаратов).
Метод Шульмана (нативный препарат) имеет определенные преимущества. С помощью этого метода можно определять яйца и личинки некоторых гельминтов. Для этого в стеклянный сосуд с водой или физиологическим раствором хлорида натрия (150 мл) погружают 3 г фекалий. Стеклянной палочкой размешивают содержимое сосуда, в результате чего в центре, у палочки, образуется воронковидное углубление. Быстро извлекают палочку и оставшуюся в ней каплю жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом, определяя яйца гельминтов и личинки.
Метод соскоба применяют для диагностики энтеробиоза, тениоза и тениаринхоза. Пользуются отточенной в виде шпателя спичкой, заостренный конец которой смочен в 1% растворе соды. Содержимое шпателя переносят на предметное стекло в каплю 1% раствора бикарбоната натрия. Сверху каплю накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом.
Метод Фюллеборна позволяет концентрировать яйца гельминтов для исследования, и поэтому вероятность обнаружения их этим способом увеличивается. Готовят раствор хлорида натрия - 350 г на 1 л воды, нагревают до кипения и фильтруют через слой ваты или марли. В фарфоровый стаканчик на 100 мл вносят 5- 10 г кала и постепенно разбавляют насыщенным раствором натрия хлорида. Клетчатку, которая всплывает, немедленно удаляют фильтровальной бумагой. Стаканчик с содержимым оставляют в вытяжном шкафу на 30 мин -1ч, на поверхности образуется пленка, в которой находятся яйца гельминтов, всплывшие в гипертоническом растворе. Проволочкой или платиновой петлей снимают пленку, наносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют. Методом Фюллеборна хорошо определяют яйца всех круглых гельминтов, кроме неоплодотворенных яиц аскарид, и карликового цепня. Яйца сосальщиков и крупных ленточных гельминтов всплывают плохо, поэтому целесообразно просматривать 2-4 препарата со дна сосуда.
Для накопления яиц по методу Телеманна необходимы эфир и соляная кислота. В пробирку наливают 1-1,5 мл эфира и 5-6 мл разведенной соляной кислоты, к раствору. добавляют небольшую часть экскрементов (1-2 г), взбалтывают, процеживают через густое ситечко в фарфоровую чашечку, сливают в центрифужную пробирку и центрифугируют 1 мин. В пробирке образуется три слоя: верхний содержит экстрагированные жиры, средний - соляную кислоту, в которой растворились белковые вещества, и нижний - нерастворенные частицы и яйца гельминтов. Два верхних слоя сливают и из осадка готовят 1-2 препарата, которые рассматривают под микроскопом. Недостатком метода является вредное действие соляной кислоты на оптическую систему микроскопа и деформирующее влияние ее на яйца гельминтов.
По способу Калантаря н 5 г фекалий размешивают в 10-кратном объеме насыщенного раствора нитрата натрия. Полученную эмульсию процеживают через редкую марлю. Через 10 мин готовят 5-6 препаратов из пленки с поверхности жидкости и исследуют их под микроскопом.
При описторхозе для определения интенсивности инвазии и эффективности проведенной терапии применяют метод количественного определения яиц в кале по Столлу. С этой целью в специальную стеклянную колбочку наливают 56 мл децинормального раствора едкого натра. Добавляют 4 г кала (до уровня жидкости в колбочке 60 мл) и взбалтывают со стеклянными бусами. Для исследования пипеткой набирают 0,075 мл (0,005 г) смеси, перенося на предметное стекло, накрывают покровным стеклом (22 х 23 мм) и под микроскопом считают количество яиц (содержащихся в 0,075 см3 смеси). Полученное число умножают на 200, в результате получают число яиц в 1 г кала. Ниже приводим краткую характеристику яиц гельминтов.
Оплодотворенное яйцо аскариды овальной формы с толстой многослойной оболочкой. Наружная белковая оболочка крупнобугристая, окрашена в темно-желтый цвет. Внутри яйца шаровидный бластомер. Размеры яйца 50-70х40-50 мкм. Неоплодотворенное яйцо аскарид удлиненной формы, белковая оболочка тонкая, мелкобугристая, желтого цвета. Внутри яйца крупные полигональные желтые клетки. Размеры 50-100х40- 50 мкм. Иногда яйца могут быть без белковой оболочки - прозрачные, бесцветные и покрыты ровной толстой оболочкой (рис. 20, 1, 2, 3).
Яйца власоглава овальной формы с толстой многослойной оболочкой золотисто-желтого или коричневого цвета. На полюсах - пробковидные образования. Внутри яйца - мелкозернистое содержимое. Размеры 50- 54х22-23 мкм (рис. 20, 4).
Яйца острицы неправильной овальной формы с тонкой гладкой бесцветной многослойной оболочкой. Одна сторона уплощена, другая - выпукла. Внутри яйца - зародыш на разной степени развития, вплоть до личинки. Размеры 50-60х20-30 мкм (рис. 20, 5).
Яйца анкилостом правильной овальной формы с тонкой прозрачной бесцветной оболочкой. Внутри свежевы-деленных яиц - 4 бластомера. Размеры 54-70х36- 40 мкм (рис. 20,6).
Яйца бычьего и свиного цепня одинакового строения, шаровидной формы; оболочка с 1-2 нитями. Внутри яйца онкосфера (зародыш) с толстой радиально исчерченной оболочкой темно-коричневого цвета, с шестью эмбриональными крючочками внутри. Размеры онкосферы 31х40 мкм. В испражнениях человека встречаются не яйца, а онкосферы (рис. 20, 7).
Яйца карликового цепня овальной формы, имеют тонкую бесцветную оболочку с лимоноподобной онкосферой внутри, от полюсов которой отходят длинные нитевидные придатки (филаменты). Размеры 40х50 мкм. В онкосфере 6 зародышевых крючечков (рис. 20,8).
Яйца широкого лентеца яйцевидной формы с толстой гладкой серого цвета оболочкой. Внутри яйца крупнозернистое содержимое, на верхнем полюсе - крышечка, на противоположном - бугорок. Размеры 68-71х45 мкм (рис. 20, 9).
Яйца кошачьей двуустки имеют тонкую гладкую оболочку бледно-желтого цвета с крышечкой на верхнем полюсе и шипиком на противоположном. Нижняя половина яйца расширена, внутреннее содержимое яйца мелкозернистое. Размеры 26-32X11-15 мкм.
Для обнаружения личинок анкилостомы, угрицы кишечной пользуются методом Бермана. 5 г фекалий на металлическом ситечке помещают над стеклянной воронкой, прикрепленной к штативу. На носик воронки одевают резиновую трубку с зажимом. В воронку наливают нагретую До 50° С воду так, чтобы нижняя часть ситечка с фекалиями была приближена к воде. Личинки активно переходят из кала в воду, скопляясь в нижней части резиновой трубки. Через 2 ч медленно открывают зажим, спускают воду с личинками в центрифужные пробирки, центрифугируют, из осадка на предметном стекле готовят препараты, которые рассматривают под покровным стеклом.
Для определения в крови личинок трихинелл взятую из вены кровь гемолизируют дистиллированной водой, центрифугируют и из осадка готовят препараты, которые исследуют под микроскопом.
Исследование дуоденального содержимого проводят так: желчь смешивают с равным объемом этилового эфира, центрифугируют; осадок микроскопируют. Кроме осадка, исследуют плавающие в жидкости хлопья, в которых могут быть яйца гельминтов.
При цистицеркозе и трихинеллезе исследуют также ткани. Кусочек биопсированной ткани - мышцы подкожной клетчатки, кожи - осматривают сначала невооруженным глазом для определения пузырька-цистицерка, длина которого 6-20 мм, ширина - 5-10 мм. При подозрении на цистицерк пузырек раздавливают между двумя предметными стеклами и рассматривают под микроскопом. Для цистицеркоза характерно наличие сколекса с четырьмя присосками и венчиком крючьев.
Чтобы обнаружить трихинеллы, асептически вырезанный кусочек мышцы (икроножной и др.) измельчают в 50% растворе глицерина на тонкие волоконца с помощью препаровальных игл. Эти волоконца сдавливают между двумя предметными стеклами и исследуют при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения. Личинки трихинелл свернуты в мышцах в виде спирали и находятся в капсулах (рис. 21).
Рентгенологический метод исследования применяют при эхинококкозе, циетицеркозе, трихинеллезе (после обызвествления личинок) и аскаридозе.
В ряде случаев используют иммунологические методы диагностики.
Гельминты, а также продукты их жизнедеятельности обладают антигенными свойствами для организма человека. В результате пребывания гельминтов в организме человека происходит аллергическая перестройка, которая может быть выявлена специальными внутрикожными аллергическими пробами. Кроме того, в организме инвазированных образуются различные антитела - комплементсвязывающие преципитины. Методы иммунодиагностики приобретают особую ценность в тех случаях, когда не может быть использована овоскопия, в частности при трихинеллезе, эхинококкозе, цистицеркозе, аскаридозе в миграционной стадии и при инвазии только мужскими особями.
При эхинококкозе и трихинеллезе ставят реакцию латекс-агглютинации, Калюса, цистицеркозе - пробу с антигеном, приготовленным Бобровым и Возной. При некоторых гельминтозах возможно применение серологических исследований: реакция преципитации личинок аскарид с сывороткой крови больного в миграционной стадии аскаридоза, реакция преципитации сыворотки крови больного трихинеллезом с антигеном из личинок трихинелл, РСК при эхинококкозе, трихинеллезе, описторхозе, цистицеркозе.
Прежде чем проводить лечебно-профилактические мероприятия при определенных гельминтозах сельскохозяйственных и промысловых животных, необходимо своевременно поставить точный диагноз болезни. Существуют две группы методов диагностики гельминтозов - прижизненные и посмертные. Кроме того, надо уметь дифференцировать гельминтозы и другие инвазионные, а также инфекционные заболевания.
Прижизненная диагностика гельминтозов
Диагноз на гельминтозы при жизни животных ставят на основании результатов лабораторных методов исследований и диагностических дегельминтизаций (прямых методов), а также иммунобиологических реакций (косвенных методов). Подсобную роль в диагностике гельминтозов играют данные исследований промежуточных хозяев (при биогельминтозах), клинические и эпизоотологические наблюдения. Основные методы диагностики - лабораторные исследования, позволяющие часто обнаруживать возбудителей гельминтозов или их яйца и личинки в экскретах (фекалиях, моче, мокроте), секретах (желчи), тканях (крови, мышцах), органах (кусочках кожи), в содержимом пунктатов и абсцессов.
Лабораторные методы диагностики гельминтозов животных легко выполнимы и достаточно точны, поэтому их широко применяют в производственных условиях (в ветеринарных лабораториях и в других ветеринарных учреждениях). В зависимости от целевого назначения лабораторные исслелования подразделяют на гельминтоовоскопические, гельминтоларвоскопические и гельминтоскопические методы исследований.
Гельминтоларвоскопические методы исследований используют для обнаружения личинок гельминтов (диктиокаул, мюллерий и др.). Из этой группы нередко применяют исследование фекалий по методам Бермана-Орлова и Вайда.
Гельминтоскопические или макрогельминтоскопические исследования применяют с диагностической целью для обнаружения выделяемых наружу гельминтов или их фрагментов (члеников нестод). В практических условиях этим способом устанавливают диагноз на аскаридоз свиней, дрепанидотениоз гусей и другие гельминтозы.
Из лабораторных методов диагностики гельминтозов животных большое практическое значение имеют: а) гельминтокопрологические исследования (исследование фекалий); б) исследование выделений других органов; в) исследование тканей.
Гельминтокопрологические исследования
Для этих же целей предложен специальный прибор, состоящий из стальных браншей, переходных ветвей и двух прикрепленных к ветвям полусферических поверхностей. Взятие фекалий из прямой кишки животных при помощи этого прибора облегчает труд ветеринарных работников и повышает производственную культуру этой манипуляции.
У кроликов фекалии в количестве нескольких шариков извлекают путем надавливания на брюшную стенку в области прямой кишки. Иногда допускается взятие проб фекалий с пола, если они свежие и известно, от какого животного. От одного животного берут не менее 10-20 г фекалий. От птиц, пушных зверей, собак, кошек и диких хищников (в зоопарках) фекалии собирают с чистого пола клеток (групповые пробы).
Все пробы фекалий этикетируют: по краю пакета или листа бумаги (где он не будет соприкасаться с экскрементами) простым карандашом пишут номер пробы (иногда и кличку коров). К пробам фекалий прилагают опись, в которой указывают наименование хозяйства, бригады, вид, пол и возраст животных (для взрослых - кличку или инвентарный номер) и дату взятия проб. В сопроводительной желательно указать цель исследований фекалий (например, для контроля проведенной дегельминтизации). Необходимо стараться быстрее доставить пробы фекалий в ветеринарную лабораторию и исследовать их без задержки, потому что при комнатной температуре через 16-20 часов из яиц кишечных стронгилят выходят личинки, что затрудняет диагностику диктиокаулеза и протостронгилидозов, а также других гельминтозов.
Если пробы фекалий в день взятия не исследуют, то их помещают в холодильник или подвал при температуре не выше 10°. Дезинфицирующие средства не приостанавливают развитие личинок внутри яиц гельминтов. Результаты исследования фекалий регистрируют в специальном журнале.
Оборудование для гельминтокопрологических исследований. Достоверность гельминтокопрологических исследований в значительной степени зависит от качества лабораторного оборудования. В 1968 г. на Украине разработан набор стандартного оборудования для массового исследования фекалий на гельмннтозы. Он состоит из предметов, изготовленных преимущественно из ударопрочного полистерола двух цветов, которые легко моются и обезвреживаются (выдерживают кипячение), а также удобны при транспортировке. В состав набора входят стаканчики различной емкости, воронки, конические пробирки, ситечки разных размеров, штатив с пятью планками (каждая на шесть воронок), кювет (по размерам штатива), коробки для хранения посуды, а также резиновые груши, стеклянные палочки и металлические петли (рис. 1).
В отличие от ранее применявшегося разнородного оборудования новый набор повышает эффективность лабораторных исследований фекалий и производительность труда ветеринарных работников, позволяет шире проводить количественные гельминтокопрологические исследования стандартизированными методами (контроль дегельминтизаций), а также улучшает эстетическую сторону этой работы.
Различают качественные и количественные методы исследований фекалий.
Качественные гельминтокопрологические исследования
Качественные методы исследований позволяют установить, какими гельминтами заражены животные.
Гельминтоовоскопические методы. Для прижизненной диагностики гельминтозов предложено большое количество методов гельминтоовоскопии, из которых рассмотрим только те, которыми чаще пользуются в ветеринарной практике.
Большинство гельминтокопрологических методов диагностики основано на разнице удельного веса яиц, личинок гельминтов или их фрагментов, с одной стороны, и жидкости, в которой взвешены исследуемые фекалии, - с другой. В зависимоти от соотношения удельного веса этих компонентов различают методы флотации, осаждения и комбинированные.
Методы флотации. При методах флотации (всплывания) используют жидкости (насыщенные растворы солей), удельный вес которых больше веса яиц гельминтов. В лабораторной практике наиболее широко применяют насыщенный раствор поваренной соли (удельный вес 1,18). Для приготовления такого раствора в кастрюлю с кипящей водой постепенно добавляют при помешивании хлорид натрия до образования на дне небольшого осадка (на 1 л воды берут около 400 г поваренной соли). Горячий раствор фильтруют в бутыль через несколько слоев марли или вату и применяют после остывания (на дне бутыли должен образоваться кристаллический осадок).
Реже в ветеринарных лабораториях используют насыщенные растворы сульфата магния с удельным весом 1,35 (920 г на 1 л горячей воды), гипосульфита натрия с удельным весом от 1,37 до 1,41, в зависимости от температуры окружающей среды (1750 г на 1 л горячей воды) и азотнокислого натрия с удельным весом 1,4 (соотношение селитры и горячей воды 1:1).
Метод Фюллеборна характеризуется простотой выполнения и высокой эффективностью при большинстве нематодозов и цестодозов животных, поэтому он занимает первое место среди других, гельминтокопрологических методов диагностики. В стеклянный, полистероловый или пластмассовый стаканчик емкостью 50-100 мл помещают 3-5 г фекалий и при помешивании стеклянной палочкой постепенно добавляют насыщенный раствор поваренной соли (хлорида натрия) из расчета на одну часть фекалий 15-20 частей флотационной жидкости. Плотные фекалии овец предварительно можно растереть с небольшим количеством раствора соли в фарфоровой ступке, после чего суспензию переливают в стаканчик, добавив необходимое количество раствора хлорида натрия. Всплывшие крупные частицы сразу удаляют палочкой, а взвесь фекалий целесообразно профильтровать в другой стаканчик через сито (иногда употребляют молочные ситечки). После отстаивания заряженной пробы в течение 45-60 минут металлической петлей снимают три капли поверхностной пленки, помещают их на предметное стекло и микроскопируют без покровного стекла. После каждой пробы петли промывают в стакане с водой (вместо рекомендуемых в некоторых руководствах прожиганий их на спиртовке).
Метод Калантарян - видоизмененный метод Фюллеборна. В качестве флотационной жидкости используют насыщенный раствор азотнокислого натрия. Время отстаивания взвеси 15-30 минут. Применяют для диагностики и акантоцефалезов.
Методы осаждения. При методах осаждения используют жидкости с меньшим удельным весом, чем удельный вес яиц.
Метод последовательного промывания. Небольшое количество фекалий (5 г) размешивают в стаканчике с 10-кратным количеством воды. Смесь фильтруют в большой стакан и доливают воду, после чего фильтрат отстаивают 5 минут. Затем сливают или отсасывают спринцовкой верхний слой жидкости до осадка; к осадку добавляют такое же количество воды, перемешивают и отстаивают снова 5 минут. Эти манипуляции повторяют до просветления верхнего слоя жидкости в стакане. Жидкость последний раз сливают, а осадок наносят на стекло или в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом. Этот метод часто применяют для диагностики большинства трематодозов и акантоцефалезов.
Метод Горшкова основан на принципе осаждения с последующей концентрацией яиц гельминтов. 150-300 г фекалий лошади помещают на металлическое сито или марлю в большую стеклянную воронку диаметром в верхней части 15-20 см. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку длиной 10-15 см с зажимом на конце. Фекалии разрыхляют и заливают доверху теплой водой. Фекалии в воронке выдерживают от 4 часов до одних суток, после чего зажим осторожно открывают, часть жидкости выпускают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 минуты. Затем жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом. Этим методом диагностируют драшейоз и габронематоз лошадей.
Комбинированные методы. Основаны на принципе осаждения и флотации яиц гельминтов, поэтому более эффективны в сравнении с предыдущими методами исследований. Ввиду сложности эти методы имеют сравнительно ограниченное применение в производственных условиях.
Метод Дарлинга. Небольшое количество фекалий (3-5 г) размешивают в стаканчике с 20-30 мл воды, смесь процеживают в центрифужные пробирки и центрифугируют 1-2 минуты, после чего верхний слой жидкости сливают, а к осадку доливают смесь равных частей глицерина и поваренной соли. Смесь в пробирках взбалтывают и вторично центрифугируют. Всплывшие на поверхность яйца снимают вместе с пленкой взвеси проволочной петлей, стряхивают на предметное стекло и микроскопируют. При отсутствии глицерина фекалии можно смешивать перед вторичным центрифугированием с насыщенным раствором поваренной соли.
Метод Щербовича. Техника исследования фекалий напоминает предыдущий метод. Отличается от него тем, что перед вторичным центрифугированием к осадку добавляют насыщенный раствор гипосульфита натрия (при макраканторинхозе свиней) или сернокислой магнезии (). По сравнению с методом Дарлинга этот метод более эффективен.
Флотационно-седиментационный метод Демидова рекомендуют для диагностики фасциолеза, а также других трематодозов жвачных. Пробу фекалий (3 г от овец и 5 г от крупного рогатого скота) помещают в стакан емкостью 200 мл и наливают в него доверху насыщенный раствор поваренной соли и тщательно размешивают стеклянной палочкой, после чего взвесь отстаивают 15-20 минут. Всплывшие на поверхность грубые частицы удаляют бумажным совочком, а надосадочную жидкость отсасывают спринцовкой (при исследовании большого количества проб жидкость можно сливать), оставляя на дне 20-30 мл осадка. К осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают. Смесь фильтруют в обычный стакан через марлю или металлическое сито и отстаивают 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка, который переносят в конический стаканчик, пропаласкивают обычный стакан и выливают смыв в маленький. Взвесь отстаивают в коническом стаканчике 3-5 минут, а жидкость в последующем отсасывают (эту процедуру повторяют). Просветленный осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют. Этот метод эффективнее метода последовательного промывания.
Гельминтоларвоскопические методы. Метод Бермана-Орлова. Для исследования фекалий используют аппарат, состоящий из средней воронки (пластмассовой, полистероловой или стеклянной), резиновой трубки (10-15 см длиной), соединенной верхним концом с воронкой, зажима, укрепленного на нижнем конце резиновой трубки, металлического сита или куска марли и штатива (для одного или нескольких аппаратов). Смонтированный аппарат заполняют теплой водой (35-38°). 10-15 г свежих фекалий кладут на сито или завертывают в марлю и осторожно опускают в воронку. Фекалии от овец выдерживают в аппарате 2-4 часа, а от телят - не менее 6-7 часов. Затем зажим на трубке ослабляют, а вытекающую жидкость собирают в пробирку и центрифугируют в течение 2-3 минут. После этого верхний слой жидкости сливают быстрым опрокидыванием пробирки, а оставшуюся на дне жидкость переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Применение зажимов на резиновую трубку в аппарате Бермана связано с неудобствами, поэтому во многих ветеринарных лабораториях нижние концы резиновых трубок непосредственно соединяют с маленькими пробирками. Перед исследованием осадка под микроскопом жидкость не центрифугируют.
Фекалии жвачных можно исследовать на легочные нематодозы (особенно в экспедиционных условиях) упрощенным методом гельминтоларвоскопии (без использования воронок). Для этой цели применяют небольшие полуконические стаканчики (50 мл). Пробы фекалий помещают на ситечки или завертывают в марлю и опускают в стаканчики с водой. Через несколько часов фекалии удаляют, жидкость из стаканчика отсасывают или сливают, а осадок микроскопируют.
Метод Вайда. Несколько шариков фекалий от мелких жвачных помещают в бактериологическую чашку или на часовое стекло и овлажняют их небольшим количеством теплой воды. Через 10-20 минут фекалии удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют под малым увеличением микроскопа. Эффективность этого метода значительно ниже в сравнении с предыдущим методом, поэтому его реже применяют для диагностики диктиокаулеза и протостронгилидозов овец.
Метод дифференциальной диагностики стронгилятозов по инвазионным личинкам. Возбудители большинства кишечных стронгилятозов имеют почти одинаковое строение яиц, поэтому при гельминтоовоскопии можно поставить только групповой диагноз (например, стронгилятозы).
Для установления более точного диагноза (родового) в ветлабораториях иногда получают культуру инвазионных личинок стронгилят. Около 5 г фекалий помещают в бактериологическую чашку, закрывают крышкой и ставят ее в термостат при температуре 25-30° на одну неделю. Затем фекалии с личинками исследуют по методу Бермана-Орлова (для выделения инвазионных личинок из фекалий).
Инвазионные личинки разных родов кишечных стронгилят отличаются по величине тела, строению хвостового конца чехлика и по количеству кишечных клеток. Например, личинки эзофагостом более крупные (до 1 мм длины), нитевидный хвостовой конец чехлика длинный, а кишечник имеет 20-32 клетки; личинки гемонхов средней длины (около 0,8 мм), с нитевидным хвостовым концом чехлика, кишечник имеет 16 клеток.
Периодическое промывание и отстаивание фекалий повторяют до просветления верхнего слоя. Верхний слой жидкости последний раз сливают, а осадок малыми порциями просматривают в кюветках с черным и белым дном. Обнаруженных гельминтов собирают при помощи пинцетов, препаровальных игл и кисточек, просматривают под микроскопом, после чего переносят в консервирующую жидкость. Чтобы выявить мелких нематод, осадок дополнительно исследуют по частям при помощи бинокулярной или штативной лупы с 10-20-кратным увеличением.
Количественные гельминтокопрологические исследования
Стандартизированный метод Фюллеборна менее точен в сравнении с методом Столла, но в виду простоты выполнения его широко применяют в ветеринарной практике для контроля эффективности дегельминтизаций животных. По технике выполнения стандартизированный метод напоминает другие методы качественных гельминтоовоскопических исследований. Однако у него имеется ряд особенностей, основными из которых являются следующие: 1) навески фекалий должны быть равными; 2) посуда одного обьема; 3) время отстаивания водных взвесей фекалий одно и то же; 4) петли одинакового диаметра, исследование равного количества капель.
Для ориентировочного учета интенсивности диктиокаулезной и прогостронгилидозной инвазии у жвачных можно применить стандартизированный метод Бермана-Орлова. Достоверность результатов повышается при увеличение количества и кратности исследований.
Исследование выделений других органов
Исследование содержимого конъюнктивальных полостей применяют для диагностики телязиоза крупного рогатого скота (возбудитель - Thelazia rhodesi). Из спринцовки орошают конъюнктивальные полости водным раствором йода; вытекающую жидкость собирают в кюветку или почковидный тазик и осматривают на наличие телязий. В данном случае водный раствор йода оказывает и лечебное действие.
Исследование истечений из клоаки проводят для прижизненной диагностики . Вытекающую слизь помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом с целью обнаружений яиц возбудителя болезни.
Исследование соскоба с перианальных складок - основной метод диагностики . Лопатковидной палочкой или спичкой, смоченной смесью равных частей глицерина и воды, делают соскоб с перианальных складок промежности и внутренней поверхности корня хвоста. Соскоб переносят на предметное стекло в каплю глицерина с водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Обнаружение яиц оксиур подтверждает клинический диагноз.
Исследование соскобов кожи из «летних язв» рекомендуется для диагностики кожной формы драшейоза и габронематоза. Соскоб берут со свежеизъязвленной поверхности кожи и помещают в каплю разведенной соляной кислоты (1:1000). Затем препарат расщепляют препаровальными иглами, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом для обнаружения личинок драшей или габронем.
Исследование тканей
Исследование кожи крупного рогатого скота (по Гнединой) применяют для диагностики онхоцеркоза. На нижней брюшной стенке у животного после подготовки операционного поля вырезают небольшой кусочек кожи толщиной 2 мм (с небольшое овсяное зерно), а ранку смазывают настойкой йода. В ветеринарной лаборатории этот кусочек кожи помещают на предметное стекло в физиологический раствор, расщепляют препаровальными иголками, а затем все сливают в центрифужную пробирку и ставят ее на несколько часов в термостат при температуре 37-38°. Затем волокна кожи удаляют, жидкость центрифугируют, а осадок микроскопируют с целью обнаружения подвижных микроонхоцерков.
Исследование кусочков мышц на часто проводят посмертно. Иногда для прижизненной диагностики трихинеллеза используют метод биопсии. Путем оперативного вмешательства вырезают кусочек мышцы (например, из наружных мышц уха), из которых готовят мелкие срезы (с овсяное зерно). Последние помещают на нижнее стекло компрессория, покрывают верхним стеклом и сближают их винтами до полного расплющивания. Просматривают срезы под трихинеллоскопом, малым увеличением микроскопа, с помощью проекционного трихинеллоскопа или проекционной камеры КТ-3.
Диагностические дегельминтизации
Для диагностической дегельминтизации отбирают несколько животных, изолируют от остального поголовья и задают им антгельминтик в терапевтической дозе. Выделенные в течение одних-двух суток фекалии от этих животных собирают и подвергают гельминтоскопическому исследованию на предмет обнаружения возбудителя болезни. В производственных условиях диагностические дегельминтизации нередко проводят для прижизненной диагностики мониезиоза жвачных, дрепанидотениоза гусей, цестодозов плотоядных, аскаридоза свиней и аскаридиоза кур.
Иммунологические реакции
Аллергические кожные реакции предложены для прижизненной диагностики фасциолеза овец, описторхоза плотоядных, и , мониезиоза овец, гемонхоза и диктиокаулеза овец, онхоцеркоза крупного рогатого скота и лошадей и трихинеллеза свиней.
Из серологических методов следует указать на реакцию сколексопреципитации, позволяющую диагностировать ранние стадии эхинококкоза и реакцию преципитации с использованием живых личинок аскарид и трихинелл для выявления соответствующих гельминтозов.
Исследование промежуточных хозяев гельминтов
Результаты гельминтологического обследования животных всегда должны дополняться данными исследований на гельминтозы промежуточных хозяев. Они позволяют выяснять гельминтологическую ситуацию, прогнозировать появление гельминтозов. Промежуточными хозяевами гельминтов могут быть моллюски (пресноводные и сухопутные), ракообразные (циклопы, дафнии, бокоплавы, водяные ослики), дождевые черви, насекомые (мухи, мошки, мокрецы, стрекозы, муравьи, жуки), почвенные клеши.
Эпизоотологическое значение имеет плотность (количественный состав) отдельных видов промежуточных хозяев. Чем она выше, тем больше имеется возможностей для заряжения животных гельминтозями. Наземные промежуточные хозяева находятся в разных местах (в навозных кучах, на выгулах, пастбищных участках и др.). Водные промежуточные хозяева в огромном количестве обитают у берегов стоячих мелких водоемов, в зарослях растений. В этих местах животные (особенно ) часто заражаются гельминтозами.
Промежуточных хозяев на наличие личинок гельминтов надо исследовать в свежем (лучше живом) состоянии под бинокулярной лупой или малым увеличением микроскопа. Личиночные стадии гельминтов в теле промежуточных хозяев находятся на разных стадиях развития, но наиболее заметными являются инвазионные личинки. В итоге исследований определяется экстенсивность (процент) и интенсивность (количество) инвазированности промежуточных хозяев личинками определенных видов гельминтов.
Орибатидные или панцирные, клещи (до 1 мм длины). Обитают в верхних слоях почвы. Это промежуточные хозяева мониезий жвачных и других гельминтов. Для обнаружения личинок ленточных червей (цистицерроидов) предварительно в капле воды на предметном стекле (под контролем лупы) расщепляют на части панцирь орибатидного клеща, затем препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Цистицеркоиды мониезий округлой формы (0,15-0,19 мм в диаметре), снабжены четырьмя присосками и хвостовым придатком. Они очень нежные, поэтому не следует применять метод компрессорного исследования клещей.
Дождевые черви других родов (Criodrilus, Eophila) обитают в водоемах с топкими, илистыми берегами. Они зарегистрированы в качестве промежуточных хозяев возбудителей гистрихоза и порроцекоза уток. Личинка гистрихиса очень крупная (до 3 см длины), беловатого цвета, просвечивает сквозь кожные покровы червя в виде волнистой полосы. Личинки порроцекумов в десять раз меньше предыдущей личинки (2,5-3 мм); они обнаруживаются в кровеносных сосудах при компрессорном исследовании дождевых червей под микроскопом.
Исследование бокоплавов. Бокоплавы достигают длины до 2 см, обитают в морских и пресноводных водоемах. Зарегистрированы они в качестве промежуточных хозяев возбудителей полиморфоза. стрептокароза и тетрамероза птиц. Личинок обнаруживают при компрессорном исследовании этих рачков. Личинки (акантеллы) полиморфуса овальной формы, оранжевого цвета, до 1 мм длины, заметны макроскопически.
Исследование водяных осликов. Водяные ослики от 1 до 1,5 см длины, живут в пресноводных водоемах, являются промежуточными хозяевами возбудителя филиколлеза птиц. При компрессорном исследовании можно выявить личинку (акантеллу) белого цвета, овальной формы, 0,7 мм длины.
Можно также исследовать и других промежуточных хозяев (мошек, мокрецов, мух, стрекоз, жуков, муравьев).
Люминесцентная микроскопия
Метод люминесцентной микроскопии (по В. Г. Эврановой) - новый метод диагностики гельминтозов. Он позволяет дифференцировать однотипные яйца разных видов гельминтов, а также отличать жизнеспособные яйца и личинки от мертвых. Предварительно яйца трематод, цестод и нематод обрабатывают растворами акридина оранжевого и другими флуорохромами. Жизнеспособные яйна и личинки нематод не люминесцируют или слабо люминесцируют, в то время как мертвые ярко светятся и окрашены в оранжевый, желто-зеленый или желтый цвет.
При люминесцентной микроскопии можно дифференцировать яйца главнейших цестод плотоядных, яйца возбудителей и гетеракидоза кур, имеющих, как известно, сходное строение по величине, форме и окраске, а также различать жизнеспособные и мертвые ооцисты кокцидий.
Препараты просматривают под микроскопом МУФ-3 или МЛ-2. Методика люминесцентной микроскопии сравнительно проста и может быть использована в производственных условиях (ветеринарных лабораториях).
Из других исследований, имеющих подсобное значение в установлении диагноза на гельминтозы. можно указать на такие, как выяснение морфологического состава крови (учет эозинофилии), метод определения фракции белков.
Краткая характеристика яиц гельминтов
Яйца представителей разных классов различаются по величине, цвету, форме, строению оболочек и внутреннего содержимого.
Яйца трематод. Чаще овальной формы с крышечкой на одном полюсе. Оболочка гладкая. У некоторых видов оболочка снабжена филаментами (отростками), бугорками. Окраска яиц от светло-серой до коричневой (чаще желтая).
Яйца цестод. Бывают двух типов: лентецов и цепней. У лентенов они напоминают яйца трематод (овальные с крышечкой). Яйца цепней резко отличаются по строению от яиц гельминтов других классов: они чаще средней величины, округлой формы, серого цвета, зрелые (внутри зародыш - онкосфера с тремя парами эмбриональных крючьев).
Яйца нематод. Отличаются от яиц трематод отсутствием крышечки; от яиц цестод - отсутствием онкосферы.
Размеры, форма, строение и цвет оболочек яиц нематод очень разнообразны. Наружная оболочка бывает гладкой, бугристой, ячеистой: толщина оболочек варьирует от тонкой (у стронгилят) до толстой (у трихоцефал). У большинства нематод яйца овальной формы, симметричные, у некоторых - получилиндрические (у драшей). Большинство нематод выделяют наружу незрелые яйца на предсегментационной стадии или нескольких шаров дробления, меньшинство - зрелые (внутри яйца сформирована личинка).
Яйца скребней. Они имеют овальную, эллипсоидную и веретенообразную формы: размер их от среднего до крупного. Выделяемые во внешнюю среду яйца содержат внутри личинку - акантор с десятью эмбриональными крючьями (зрелые).
Клинические наблюдения
Эпизоотологические данные
При диагностике многих гельминтозов сельскохозяйственных животных значительную помощь оказывают эпизоотологические данные (неблагополучие хозяйства по конкретным болезням, сезон года, возраст больных животных, характер пастбищ и водоисточников, метеорологические условия и др.). Например, массовое заболевание с признаками брюшных водянок и падеж овец осенью после дождливого лета и использование под выпасы заболоченных участков пастбищ дает основание заподозрить острую форму фасциолеза. Заболевание гусят летом с признаками расстройства пищеварения (поносы) и нервной системы (парезы) после выпаса их на мелком стоячем водоеме, обильно заселенном циклопами, является основанием для установления предполо-жительного диагноза на дрепанидотениоз. Падеж ягнят весной (через 3-4 недели после начала пастбищного содержания) должен вызвать подозрение о заболевании молодняка овец мониезиозом. Необходимо также учитывать зональные особенности гельминтозов домашних животных, желательно в комплексе с клиническими наблюдениями.
