Рис. 8. Принцип иммуноэлектрофореза.
Стадия 1: электрофорез антигена в агаровом геле. Антиген мигрирует на некоторое гипотетическое расстояние.
Стадия 2: ток выключен. В агаре вырезана канавка и заполнена антителами. Образуется дуга преципитации. Теоретически антиген диффундирует из точечного источника радиально, а антитела из канавки - ровным фронтом. Преципитаты, образующиеся в точках оптимальных соотношении антигена и антител, формируют дугу. Дуга расположена ближе всего к канавке там, где наиболее высока концентрация антигена.
Иммуноэлектрофорез помогает идентифицировать антигены по электрофоретической подвижности, особенно в том случае, когда в образце присутствуют и другие антигены.
С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов и идентифицируют миеломные белки (рис.9).
Рис. 9. Основные классы иммуноглобулинов человека в сыворотке крови, выявляемые методом иммуноэлектрофореза. В канавку добавлена антисыворотка кролика. Показано расположение основных глобулиновых фракций. Выявлены три из пяти основных классов иммуноглобулинов человека: IgG, IgА и IgМ. Дуга преципитации IgG, распространяется от γ-области до ά 2 -глобулиновой области, что отражает чрезвычайную гетерогенность популяции антител как по аминокислотному составу, так и по суммарному заряду.
На основе сочетания электрофореза с иммунопреципитацией разработано несколько удачных методов, в каждом из которых перемещение антигена в электрическом поле приводит к его контакту с антителами. Встречный иммуноэлектрофорез может применяться для определения антигенов, мигрирующих в агаре к положительно заряженному электроду.
Рис.10. Встречный иммуноэлектрофорез. Из-за эндосмоса антитела движутся в геле «назад»; антиген, отрицательно заряженный при данном рН, перемещается к положительному электроду и при контакте с антителами образует преципитат.
Данный метод занимает меньше времени и более чувствителен, чем двойная диффузия по Ухтерлони. Его применяют для идентификации антигенов вируса гепатита В и соответствующих антител, антител к ДНК при системной красной волчанке, аутоантител к растворимым ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преципитинов) к Asperqillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе.
Ракетный электрофорез - это количественный метод, предусматриваю-щий внесение антигена в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет форму ракеты, длина которой определяется концентрацией антигена.
Рис.11. Ракетный электрофорез. Антиген, в данном случае сывороточный альбумин человека, подвергается электрофорезу в геле, содержащем антитела. Расстояние между стартовой лункой и передним краем дуги, имеющей форму ракеты, зависит от концентрации антигена. В данном случае относительные концентрации сывороточного альбумина человека составляют (слева направо) 3, 2 и 1.
Как и встречный электрофорез, это- быстрый метод, но и здесь антиген должен перемещаться к положительно заряженному электроду. Таким образом, ракетный электрофорез подходит для белков, например альбумина, трансферрина и церулоплазмина, в то время как концентрацию иммуногло-булинов обычно определяют методом простой радиальной иммунодиффузии.
Один из наиболее удачных вариантов ракетного электрофореза - двумерный или перекрестный иммуноэлектрофорез Лорелла. При этом на первом этапе смесь антигенов электрофоретически разделяют в геле агарозы. Затем разделенные белки вновь заставляют диффундировать в геле под влиянием электрического поля в другом направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно определить каждый из антигенов смеси. Наиболее впечатляющий пример-это оценка степени конверсии СЗ в инактивированную форму СЗс, которая часто происходит при обострении в сыворотке больных системной красной волчанкой или синовиальной жидкости пораженных суставов в острой фазе ревматоидного артрита, а также в других случаях.
Рис.12. Перекрестный иммуноэлектрофорз.
а. Антигены разделяются по электрофоретической подвижности в агаровом геле. Узкую продольную полоску (ограничена прерывистой линией), содержащую разделенные антигены, вырезают из геля и прикладывают к другому гелю, содержащему антисыворотку. Затем проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном первому; при этом антигены реагируют с антисывороткой, содержащейся в геле, с образованием пиков преципитации. Площадь под пиком зависит от концентрации данного антигена.
б. Электрофореграмма, показывающая превращение компонента комплемента СЗ (С3 → С3с) в сыворотке. Гель дополнительно окрашен. В данном случае дуги сливаются между собой, поскольку антигены имеют общие детерминанты.
в. «Горная фантазия», - эта электрофореграмма, демонстрирует удивительные возможности перекрёстного иммуноэлектрофореза для разделения сложной смеси антигенов.
Иммунофлюоресценция заключается в том, что к молекуле антител присоединяется какой-либо флюоресцирующий краситель, например изотиоцианат натрия. Антигенный материал (бактерии, клетки или их компоненты), присоединившие меченые антитела, становятся видимыми в ультрафиолетовом свете. Метод не количественный, но весьма важный в иммуноморфологии для определения локализации антигенных структур или антител.
Конкуренция с радиоактивным антигеном (радиоиммунологический метод) - один из самых современных методов. Учет реакции антиген - анитело может осуществляться с помощью радиоизотопных методов в случае использования «меченых» антител или антигенов. Измерение радиоактивности преципитата дает возможность оценить количество антител или антигена в исследуемых образцах. Это увеличивает объективность оценки, убыстряет учет и повышает чувствительность реакции. Наиболее чувствии-тельны (определение 1 - 10 нг вещества) методы конкуренции за антитела немеченого антигена с меченым. Принцип метода заключается в следующем. Используют стандартное количество антисыворотки против исследуемого антигена и стандартное количество этого антигена, меченного радиоактив-ными 125 I, 131 I, 2 Н или другим изотопом. Соотношение их таково, что 70-80% меченого антигена связываются антителами, образовывая радиоактивный преципитат с величиной радиоактивности N. Если в реагирующую систему внести исследуемый на присутствие данного антигена субстрат, то при наличии антигена он конкурирует с меченым антигеном и радиоактив-ность преципитата снижается. Чем больше антигена в исследуемом образце, тем меньше радиоактивность преципитата. С помощью этого метода определяют концентрацию в крови, моче и других субстанциях таких веществ, которые из-за ничтожных концентраций не выявляются биохимическими методами (гормоны: инсулин, гормон роста, АКТГ, го-надотропин, дигоксин, соматотропин и др.).
Рис. 13. Метод выделения мембранного иммуноглобулина (IgМ - 8S) с поверхности В-лимфоцитов.
1. Мечение поверхностных белков лимфоцитов 125 I в присутствии лактопероксидазы (ЛП).
2. Лизис клеток и выход поверхностных белков в раствор.
3. Осаждение меченых иммуноглобулинов с помощью специфической анти-Ig-сыворотки.
4. Отмывание и осаждение преципитата.
5. Разрушение преципитата и электрофоретический анализ легких и тяжелых цепей в полиакриламидном геле
Иммуноферментный метод представляет собой разработку самых последних лет. По чувствительности он не уступает предыдущему, но более прост при наличии коммерческих реагентов. На стенки полистереновых пробирок сорбированы антитела против определенного антигена. В эту пробирку вносят исследуемый субстрат. При наличии данного антигена он соединяется с антителами. Субстрат сливают и в пробирку вносят антитела против этого же антигена. Эти антитела мечены ферментом, чаще всего пероксидазой хрома. Меченые антитела присоединяются к предыдущему комплексу и также остаются на стенках пробирки. Содержимое пробирки заменяют на смесь хромогена (ортофенилендиамин) с субстратом для данного энзима - Н 2 0 2 . Если в исследуемой жидкости был искомый антиген, энзим фиксируется на стенках пробирки, разложит Н 2 0 2: выделившийся кислород окрасит хромоген в желтый цвет.
Метод Уанье предполагает использование для учета преципитации фотоэлектронефелометра, с помощью которого регистрируется изменение оптической плотности сыворотки после добавления антигена. При разбавлении сыворотки дистиллированной водой оптическая плотность снижается. Если в сыворотке имеются антитела, а в качестве разбавителя используют водный раствор антигена, то кривая изменения оптической плотности будет иная. Вначале происходит снижение оптической плотности, при накоплении достаточного количества антигена снижение прекращается, затем наблюдает-ся повышение оптической плотности смеси антиген - антитело.
Феномен лизиса - способность некоторых антител растворять клетки, против которых они возникли. Эти антитела применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам - эритролизинами, или гемолизинами. Реакции иммунного лизиса характеризуются тем, что они не происходят при наличии только двух ингредиентов - антигена и антитела. Необходимо присутствие третьего компонента, получившего название комплемента. В разных количествах комплемент содержится в сыворотке крови многих животных; особенно много его в сыворотке крови морских свинок. Вначале реакция идет по типу агтлютинации, затем к комплексу антиген-антитело присоединяется комплемент и происходит локальное растворение оболочки бактерий, эритроцитов или других клеток.
Феномен цитотоксичности определяется антителами, называемыми цитотоксинами. Их действие заключается в том, что они проявляют токсический эффект, лишая клетки жизнеспособности. Реакцию по выявлению цитотоксинов ставят со взвесью клеток в изотоническом буферном растворе хлорида натрия. К ним добавляют краситель, например, эозин или трипановый синий. Живые клетки не красятся, погибшие клетки быстро воспринимают краску (в течение 30 с). Если к взвеси клеток доба-вить иммунную сыворотку, содержащую цитотоксины и комплемент, то клетки будут гибнуть и при пробе с красителями окрасятся. Процент погибших клеток свидетельствует о количестве цитотоксинов в сыворотке крови. Реакция требует обязательного присутствия комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) основана на описанном выше свойстве комплемента присоединяться к комплексу антиген - антитело. Говоря более точно, комплемент фиксируется на специальном участке тяжелой цепи молекулы антитела. Однако этот участок становится доступным только после присоединения антитела к антигену. Соединившись с одним комплексом антиген - антитело, комплемент не может перейти на другой комплекс, вводимый в реагирующую систему после взаимодействия первого комплекса и добавленного в известном количестве комплемента. В качестве второго комплекса обычно используют так называемую гемоли-тическую систему - смесь эритроцитов барана с антителами против них. Если первый комплекс является комплексом антиген - антитело, то свободного комплемента в реагарующей смеси не будет; гемолиза эритроцитов не произойдет. Наоборот, если в исследуемом материале (например, в сыворотке крови) нет антител к использованным антигенам, то комплемент останется свободным и обеспечит гемолиз эритроцитов. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), изучений противотканевых антител и аутоантител; она широко используется при диагностике ряда вирусных инфекций.
Феномен специфической задержки часто используют для сравнения двух изучаемых антигенов. Например, готовят иммунную сыворотку против эритроцитов мыши. Чтобы определить, содержатся ли в ней антитела против эритроцитов родственного вида животных (крысы), сыворотку обрабатывают эритроцитами крысы. Если уровень антител в сыворотке снижается, то имеются родственные антигены, если совсем падает, то антигены идентичны. С помощью этой реакции проанализированы на тождественность или нетождественность многие родственные антигены и гаптены.
Реакция нейтрализации токсинов . Антитоксинами называют антитела против бактерийных и некоторых других (например, змеиный яд) токсинов антигенной природы. Антитоксины, соединяясь с соответствующими токсическими веществами, нейтрализуют их. Степень нейтрализации может быть учтена посредством введения восприимчивому животному смеси токсин- антитоксин. Количество антитоксина в иммунной сыворотке характеризуют тем количеством минимальных смертельных доз токсина, которое может быть нейтрализовано определенным количеством сыворотки. Реакцией нейтрализации пользуются для определения концентрации токсинов возбудителей дифтерии, столбняка и др. Для этого применяют стандартизированные антитоксические сыворотки.
Феномен опсонизации заключается в том, что антитела усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов в отношении тех антигенных субстанций или микроорганизмов, против которых они получены. Например, активность фагоцитов в отношении стафилококков значительно усиливается, если обработать лейкоциты или донора лейкоцитов антистафилококковой сывороткой. Такое действие связывали с наличием особых антител опсонинов. Следует, однако, иметь в виду, что специальных антител опсонинов, гемолизинов, бактериолизинов или преципитинов нет. Это лишь проявления основной функции молекул иммуноглобулинов дать специфический комплекс антиген - антитело.
Д. Грей приводит хороший пример единства и многообразия этой функции. Антитела, приготовленные против пневмококкового полисахарида I типа, могут:
1) вызывать агглютинацию пневмококков I типа и набухание их капсулы;
2) вызывать преципитацию растворимого экстракта из пневмококков I типа;
3) присоединять комплемент, т. е. обеспечивать РСК;
4) оказывать опсонизирующее действие на лейкоциты в отношении пневмококков I типа;
5) осуществлять специфическую защиту животных против пневмококковой инфекции.
Несмотря на это, в различных конкретных экспериментальных или клинических ситуациях предпочтение отдают конкретным реакциям антиген - антитело. При диагностике брюшного тифа используют реакцию Видаля - агглютинацию бактерий, для анализа антигенных компонентов сложных биологических жидкостей или тканевых экстрактов - реакции преципитации в агаре в виде иммунодиффузии или иммуноэлектрофореза. При работе с токсинами и многими растворимыми антигенами пользуются методами пассивной гемагглютинации. Для определения уровня гормонов в крови наиболее приемлем радиоиммунологический метод и т. д. Различные классы иммуноглобулинов различно проявляют функцию соединения с антигеном.
Изобретение относится к лабораторному оборудованию. Цель изобретения - сокращение времени проведения исследований и уменьшение расхода геля. Устройство содержит кювету 1, перегородку 2, буферный раствор 3, держатель 4 геля с крышкой 11 и электроды 12. В держателе 4 на его рабочей поверхности выполнены горизонтальные пазы, соединенные каналами с полостями по разные стороны от перегородки. В крышке 11 выполнены ряды отверстий 7 и 8, расположенных попарно над каждым пазом. Держатель и крышка выполнены из прозрачного материала. Сыворотки помещают в отверстия 7 и 8 и включают блок питания. В результате реакции образуется осадок, по которому судят о наличии или отсутствии антигена. Реакция происходит в закрытом блоке, гель заполняет не весь держатель, а только пазы, что позволяет уменьшить его расход. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТБУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 2)11 4)6111(1>(-1-1 (221 1(1.(н>.Х7
I 4t> I;3(I. I (j.>Ü. I «>. i X 4(1 (711 Веееон)зн>>й н(е.(ь(ни и и конетр3ктрскии нне гит уг 31(ьннинекой лбор >трной текнпки (721 В. (!. (:оболе(3, . 3. В. Ьап(тано>3, В.. 1. Вон,iüåв и 3. В. (;г3 IIHh(>в
N (}6)7471), кл. А 6! В 5i ():), 1(177.
1541 У(. E С3(г1(:Th() L, 15(!! Р()ВЕ:., ((.1!1! SI
1! У:) (У((ОЭ.1(}..(;ТР(.)ФОР! .3>"3 В (l, 1(. (571 И (обреT(ни(от ноеите>1 к 1«l()()j) ()),"(онвин) I I(.lb tt 3(>()е l (. ния окрап(епис времени провеявll. я нее.>елова1ени<.>„„SU„„15179 8 А 1 (5() 4 А б(В 5/04, С(01 3 33)48
2 ео и(1.11 hv>ttl г„(, перегоролку —, б 1),(,терж»те.>ь 4 геля е крышкон 11 II s.(ектролы 12. В лержателе 4 на его
Раен>и ll ПОВСРКНОЕтн ВЫПО.>Н kibl Г)РИЗОНт;1.>ьHl,i(113>bi, соединенны(каналачи е полоетями по E);t 1 п(>зоч.,((ржатель и крышка выполнены из нрнраиного ч;>тс риала. Сы(>с>ротки пс>м«п11>н>т в гверетия 7 и 8 и вклн)11)н>т блок витания. В ре T 3T(. реак((ии обрдз3е1 и;i.t(>h, и кT()I)«%ted е) лят о н,) ,(и«Hll lt, lit о «: ан». l (ll »п и ll. к(). 1ит 13 3 1 кE>tT(>M (<.1>h(, Г(. l ь 3 ,!в
tl >t(ll а.(Ь1, И T(> нов>;о 1,1() 3 ъ1еHbllll(Tb (го Р;t 1 3, и
Формула изобретения
Изобретение относится к медицинской технике и может быть использовано в работе службы крови, инфекционных отделениях
6ольниц, в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений.
Цель изобретения сокращение времени пр()ведения исследований и уменьшение расхода геля.
На фиг. 1 изображено устройство для
II!)()k3åäåíèß Реd)I(HI(; kid фиг. 2 деРжатель, разрез, на фиг. 3 то же, вид сверху.
Устройство для иммуноэлектрофореза со1(ржит кк)вету 1, разделенную по всей длине перегородкой 2 на две части, образую)цие буферно-электродные пространства, наполненные буферным раствором 3.
111k перегородку 2 установлен держатель 4 гс I)I, представляющий собой п роз рачн ы и
6 1()k, который содержит ряд пазов 5, кот()!)bl(. образуK)T автономные каналы, соединяющие буфер 3 по обе стороны от перегородки 2. Каждый канал имеет по два ()Tk3cpcTkIkI б для Внесения в них сынор()тки 7 и ацтисыворотки 8. Каналы отделены дрхг от друга тонкой стенкой 9.
Для проведения электрофореза в устройств«готовят веронал-мединаловый буфер из барбита.l I натрия (мединал 17,5 г и барГ>и I I.ld Ве!)он 1)л) 2,7 г В 1000 мл дис1 и,з, l)11)()k)k)IIII()II Вольl.
Гол ь г() говяз из 1)гара фи pMI>
k.(»I1kckIT1),1ции г агара на 100 мл буф«рного растнора.
11ере.l нича)ом электрофореза пазы 5 заи().)няк)1 носителем 0 (агаровым гелем), 3dT(I в геле дслак)т углубления, в одно
I I 3), r)) 6. 1 е н и и В и ос Я т с ы В о р от к х 7, В I I 1) о Г иВоположное антисыворотку 8. В обе часI и klok)Eты зал иван)т буфер 3, держатель устинаB.II)k)dk()T иа перегородку 2. Кюв Tv
3dk !)I l«d l() l крышкой 11 с электрода ми 2.
Устройство работает следующим образом.
На камеру подают постоянное напряжение. При прохождении постоянного тока через цепь электрод буфер — носитель— буфер — электрод антигены и антитела двигаются навстречу друг другу и, взаимодействуя, образовывают преципитат, видимый невооруженным глазом. Осадок позволяет судить о наличии или отсутствии
1О антигена в исследуемых сыворотках. Таким образом, можно выявлять больных клещеk3blM анцефалитом, менингитом, сывороточным гепатитом и другими иммунологическими заболеваниями.
В предлагаемом устройстве для проведе-! 5 ния электрофореза значительно упрощается технология изготовления, исключается держатель сложной конструкции, а за счет того, что реакция происходит в закрытом блоке, и испарение и другие внешние факторы не могут повлиять на помещаемые в пазы 5 сыворотку и носитель, крышку можно изготавливать плоской. Таким образом улучшаются показатели качества.
1. Устройство для проведения иммуноэлектрофореза в геле, содепжащее кювету, электроды, перегородку, разделяющую кювету камеры на две полости, и держатель геля, установленный на перегородке, отличающееЗь) гя тем, что, с целью сокрашения времени проведения исследования и уменьшения расхода геля, держатель выполнен с горизойтальными пазами на рабочей поверхности, соединенными каналами с разными пол(тетями кюветы, и снабжен пластиной, Ç5 соприкасающейся с его рабочей поверхностью и имеющей ряды отверстий, расположенных попарно над каждым пазом.
Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. Существуют различные варианты иммуноэлектрофореза. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) впервые описан Грабар и Уильямс в 1953 г. В 1955 г. Шейдеггер предложил микромодификацию этого метода, применив обычные предметные стекла.
Принцип ИЭФ состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков (антигенов) в забуференном геле агара; после снятия напряжения вдоль направления движения белков в электрическом поле в геле вырезают канавку, в которую вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.
С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов различных классов, идентифицируют миеломные белки. Также ИЭФ используется при диагностике иммунодефицитных состояний. Метод незаменим в последовательном наблюдении за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов.
Для разделения сложной смеси антигенов используют двухмерный (перекрестный) электрофорез. Метод включает два этапа. На первом этапе белки диффундируют под влиянием электрического поля в агарозном геле, содержащем антитела. На втором этапе пластину поворочивают на 90 о и подвергают повторный разгонке в направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно охарактеризовать каждый из антигенов смеси. Этот метод, в частности, применяют для оценки степени конверсии белка системы комплемента С3 в инактивированную форму С3с в сыворотке больных СКВ или синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом.
Электроиммунный анализ
Метод впервые был предложен Лореллом в 1966 г. Гель агарозы, содержащий антисыворотку, распределяют равномерным слоем по плоской поверхности. Препарат, содержащий антиген вносят в различных разведениях в серию последовательных лунок в геле. Из лунок под воздействием постоянного электрического тока антигены мигрируют в слой агарозы, где они взаимодействуют с иммуноглобулинами. В результате этого взаимодействия образуются преципитаты АГ-АТ, приобретающие вытянутую, заостренную форму, напоминающую ракету. Отсюда другое название метода – ракетный иммуноэлектрофорез. Длина зоны преципитации при прочих равных условиях (концентрация геля, концентрация антисыворотки в геле, толщина слоя геля, режим электрофореза) находится в прямой зависимости от концентрации антигена. ЭИА используют для количественного определения белков в жидкостях организма.
Встречный электрофорез
Принцип встречного электрофореза применил в 1969 г. Бедарида для обнаружения преципитатов АГ-АТ. Иммунопреципитация происходит в слое носителя, причем в отличие от метода Ухтерлони контакт антигена с антителом происходит не вследствие свободной диффузии, а под влиянием постоянного электрического поля. Белки представляют собой амфолиты; ввиду различий аминокислотного состава они могут мигрировать в щелочной среде с разной скоростью и в разных направлениях (анодном, катодном). Если антиген и соответствующая преципитирующая антисыворотка мигрируют в разных направлениях, становится возможным их движение друг навстречу другу в слое геля или на ацетатцеллюлозной пленке. Преципитация наблюдается между стартовыми лунками обоих компонентов в течение 30-180 мин в зависимости от приложенного напряжения. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) предназаначен для обнаружения и индентификации преципитирующих систем АГ-АТ при условии, что антиген обладает электрофоретической подвижностью, отличной от той, которой обладают иммуноглобулины. ВИЭФ используют для индентификации антигенов вирусного гепатита В, антител к Aspergillus при бронхолегочном аспергилизе, антител к N.meningitidis, антител к ДНК при СКВ.
Описание
Сыворотка для ИЭФ содержит антитела против белков сыворотки крови человека. В иммуноэлектрофорезе с нормальной сывороткой крови человека препарат должен выявлять не менее 15 линий преципитации в соответствующих зонах: в a-зоне – альбумин, a 2 -макроглобулин; в β-зоне – трансферрин, церулоплазмин; в γ-зоне – линии IgG, IgА, IgМ и др.
Сыворотка должна полностью растворяться в течение 5 мин после добавления в ампулу (флакон) 1,0 мл воды очищенной. После растворения сыворотка должна быть прозрач¬ной, без осадка и посторонних включений, розова¬то-желтого цвета. Допустима небольшая опалесценция в проходящем свете.
Форма выпуска
Выпускается в ампулах по 1 мл (10 флаконов).
Состав
Сыворотка для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков крови человека сухая представляет собой лиофилизат иммунной сыворотки крови овец, иммунизированной нормальной сывороткой крови человека.
Набор состоит из сыворотки для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков крови человека.
Сыворотка для ИЭФ против сывороточных белков крови человека. Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета 10 ампул (флаконов) по 1 мл
Показания для применения
Предназначена для качественного и количественного определения иммуноглобулинов и различных белков в сыворотке крови, других биологических жидкостях человека и препаратах крови методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ).
Режим дозирования и способ применения
Анализируемые образцы следует хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 7 сут или при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Замороженные образцы перед исследованием следует разморозить и тщательно перемешать путем встряхивания. Повторное замораживание не допускается.
ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
Оборудование: прибор для иммуноэлектрофореза с выпрямителем электрического тока, весы аналитические, плитка электрическая, рН-метр, холодильник, предметный столик с регулируемым уровнем, пластины стеклянные (90 × 120) мм, влажная камера, мерная посуда, дозаторы пипеточные со сменными наконечниками, контейнер для обеззараживания.
Реагенты и материалы:
– агар;
– амидо черный 10Б;
– веронал;
– вода очищенная;
– глицерин;
– кислота борная;
– кислота уксусная;
– мединал;
– мертиолят (тимерозал);
– натрий тетраборнокислый 10-водный;
– натрия хлорид;
– пиронин Б;
– бумага фильтровальная лабораторная;
– перчатки одноразовые;
– дезинфицирующие растворы.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Иммуноэлектрофорез.
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с сывороткой для ИЭФ и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.
Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л);
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.
Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерную колбу на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.
Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление агарового геля 1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90±120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев.
Соединение агара на пластинах с буферным раствором возможно и с помощью агаровых мостиков.
Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп, а после проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара заполнить их с помощью пипеточного дозатора растворенной контрольной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).
Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенную сыворотку для ИЭФ. Пластины поместить во влажную камеру и выдержать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 48 ч.
После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации.
Окрашивание агара.
Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б. Для этого пластины поместить в кюветы, залить натрия хлорида раствором 0,9 % и выдержать в течение 16-18 ч для отмывания от непреципитировавших белков. Затем пластины с агаровым гелем накрыть фильтровальной бумагой, смоченной в натрия хлорида растворе 0,9 %, и высушить на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку.
С высушенных пластин снять фильтровальную бумагу и поместить в кюветы с красящим раствором на 30-40 мин. Затем отмыть в растворе для отмывки агара после окрашивания в течение 5-10 мин и снова высушить.
Учет результатов.
Учет результатов проводить визуально.
Иммуноэлектрофорез - один из широко распространенных методов качественного анализа антигенов. Располагая соответствующими преципитирующими АС, с его помощью можно исследовать любую антигенную смесь. В частности, успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения. В клинике этот метод чаще всего используется при диагностике парапротеинемий и иммунодефицитных состояний. В судебной медицине с его помощью анализируют системы гаптоглобина и группоспецифического компонента Gc.
В научно-исследовательской работе иммуноэлектрофорез служит основным методом идентификации белков, содержащихся в сложных смесях. Он незаменим как метод последовательного наблюдения за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов. Естественно, что метод, имеющий столь широкое применение, должен был видоизменяться и совершенствоваться в различных направлениях. Были предложены новые носители: гель агарозы, ПААГ, ацетат-целлюлозные пленки.
Вместе с тем ИЭФ стали комбинировать с различными методами специфического окрашивания и флюорохромироваиия, чтобы выявлять ферменты, углеводы, липопротеиды, нуклеопротеиды. В результате комбинации с другими методами анализа возникли диск-иммуноэлектрофорез, иммуноэлектрофокусирование, радиоиммуноэлектрофорез и др. Для количественного определения с помощью полиспецифических АС недавно был предложен двухмерный ИЭФ. Особая модификация двухмерного ИЭФ может повысить его чувствительность до уровня РИА. Это достигается электрофоретической элюцией антигена из малых стеклянных резервуаров объемом 0,1-10 мл. Для ИЭФ с охлаждением Виме сконструировал прибор, автоматически поддерживающий постоянную температуру и силу тока в процессе разделения.
Этот прибор очень удобен для определения электрофоретической подвижности различных веществ. Использование в этом приборе термоэлектрического охлаждения (батарея Пельтье) следует особенно рекомендовать в случае работы с ферментами и другими термолабильными веществами. Недавно был предложен простой способ разделения белков в двухмерном электрофорезе. Известен чувствительный способ определения непреципитирующих систем антиген-антитело, основанный на применении МКАТ, так называемый каскадный ИЭФ, включающий фиксацию АГ после электрофореза, присоединение к антигенам антител, удаление связанных антител и их количественная оценка.
В случае иммунофиксационного электрофореза разделяются AT, а не антиген. Это быстрый и экономичный метод, он особенно пригоден для массового обследования с целью выявления парапротеинемии и для получения препаратов белков. При ИЭФ нередко наблюдаются нарушения нормального течения процесса, и не всегда удается сразу обнаружить их причину. Если, например, используется недостаточно очищенный агар, но это чаще всего приводит к трем нарушениям: плохому образованию геля, сильному электросмосу, плохому обесцвечиванию препаратов. Недостаточно чистый агар всегда подлежит очистке. Приступая к работе с новой порцией агара, нужно сначала испытать его годность. Часто обнаруживается, что одни и те же антигены имеют разную электрофоретическую подвижность и по-разному окрашиваются при употреблении различных партий агара. Причиной нарушений при ИЭФ может быть гидролиз агара, вследствие многократного или слишком длительного нагревания.
О гидролизе свидетельствует ослабление гелеобразующих свойств и возникновение неровностей на поверхности геля. Электрофоретическое разделение может быть нарушено при использовании неподходящего буферного раствора. Большинство буферов служит хорошей питательной средой для бактерий и плесневых грибков. Поэтому запас буфера следует хранить в холодильнике или добавлять к нему консервант. Буфер, заполняющий электрофоретическую камеру, следует менять не реже одного раза в неделю. При многократном использовании электродного буфера необходимо после каждого разделения менять полюса электродов. Величина напряжения на клеммах камеры обычно не позволяет судить о физической силе тока, проходящего через гель, поэтому в цепь нужно последовательно включить миллиамперметр. В процессе разделения сила тока почти всегда повышается. Это явление обусловлено нагреванием геля, которое нарастает с увеличением продолжительности электрофореза.
Однако после первоначального подъема сила тока в цепи может упасть. Часто это происходит из-за подсыхания полосок фильтровальной бумаги, соединяющих гель с буфером, или даже из-за подсыхания самого геля. В этом случае следует уменьшить ионную силу буфера или напряжение на клеммах камеры. Кроме того, высыхание можно предотвратить, если перед электрофорезом обернуть пластинку геля и полоски бумаги полимерной пленкой. Удобнее всего работать с источником, который обеспечивает постоянную силу тока (стабилизация тока). Самой собой разумеется, что результаты ИЭФ зависят от качества антигенов и антисывороток.
