Роль грибковой инфекции в патологии человека. Диагностика микозов

Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.

При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)

Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:

1. Окраска PAS -методом. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.

PAS -реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.

2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.

3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий , то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.

Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.

Микологическое исследование

Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel ).

Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30 0 С, 20-25 0 С, реже 37 0 С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет до 6 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 6 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.

При культуральном исследовании диагностически значимым являются:

Выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

Выделение диморфного гриба.

Алгоритм микологического исследования

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:

Микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);

Характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).

Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов

1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.

3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.

4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.

5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений

10 -фекалии, моча;

10 – мокрота.

6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба

7. Наличие антител к выделенному штамму.

Микологическое исследование отделяемого слизистых

1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.

Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +37 0 С в течение 48 часов:

После пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;

Если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.

Микологическое исследование крови

1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.

2. Культуральное исследование.

5-10мл крови засевают в 50-100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозой. При температуре 37 0 С их инкубируют в течение недели;

Через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;

Засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 37 0 С;

Если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.

Микологическое исследование биоптатов

1.Для забора материала используют метод отпечатков.

2. Культуральное исследование:

Делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;

Этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);

Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 5 дней.

Первый прием

Лабораторная диагностика

Самыми эффективными методами диагностирования микозов кожи являются различные лабораторные исследования, которые способны выявить возбудителя и помочь в подборе схемы терапии. Для выявления возбудителя микоза назначают такие лабораторные исследования:

• гистологический анализ;
• бактериологический посев;
• иммунологическое исследование;
• ПЦР-диагностирование;
• культуральное обследование;
• микробиологические исследования.

Микробиологическая диагностика является наиболее распространенным и самым простым методом выявления микоза в крови и на коже. Для выявления точного диагноза, следует знать, как правильно собирать материал, который необходим при исследовании. Пораженные волосы следует собирать при помощи пинцета. Если инфицирована кожа, то для микроскопии следует соскоблить с поврежденного участка кожный покров. Весь забранный материал помещают в 30% раствор гидроксида калия, а затем на предметное стекло. Микробиологическая диагностика способна выявить, где именно расположен грибок (внутри или снаружи волоса, кожи) и его размеры.

Чтобы предотвратить ошибочный диагноз микоза, следует правильно и грамотно забирать материал для микробиологического обследования.

В медицине существуют такие методы микробиологической диагностики:

• Микроскопия с применением нативных или неокрашенных препаратов. Для этого материал осветляют с помощью 10-30% растворов гидроксида калия или натрия. Затем обработанный материал кладут на лабораторное стеклышко, куда предварительно накапали немного глицерины. Сверху прикрывают стеклянной пластинкой и проводят анализ.
• Микроскопию окрашенных препаратов проводят несколькими способами, которые идентифицируют бактерии, дифференцируют различные бактерии и выявляют разные грибы.

Бактериологический посев

Бактериологический посев – один из самых эффективных методов для диагностики.

Сбор бактериологического посева на питательную среду является точным способом диагностики микоза. Учитывая внешний вид и характеристики выросшей колонии грибка, дерматолог устанавливает тип возбудителя, вызвавшего микоз. Единственный минус обследования в том, что требуется много времени, чтобы вырастить колонию. В среднем необходимо около 3-х недель, чтобы выяснить штамм возбудителя. В некоторых случаях метод не приносит ожидаемых результатов.

ПЦР-диагностика

Метод ПЦР-диагностирования предполагает выявление возбудителя микоза с применением полимеразной цепной реакции. При обследовании увеличивается чувствительность гибридизации, что повышает содержимое вирусного ДНК в исследуемом материале. Этот метод обследования является новым и требует нескольких анализов от пациента. Считается, что такой вид диагностики достаточно затратный, но дает точные результаты.

Культуральное обследование

Культуральные диагностические мероприятия рекомендуются на финальном этапе постановки диагноза. Метод заключается в получении культуры грибка, которая потом отправляется на обследование с помощью микроскопа. Полученный материал кладут на искусственно созданную питательную среду и выявляют род возбудителя, внешний вид, размеры. После чего показано специальное лечение, которое направлено на борьбу с конкретным видом возбудителя микоза.

4402 0

К сожалению, и в настоящее время можно констатировать, что диагностика грибковых заболеваний нередко бывает несвоевременной (зоны поредения волос, шелушение часто принимаются за «перхоть», «сухость»). При этом субьективные ощущения (зуд, боль и др.) в очагах поражения зачастую не бывают, и больные в силу этого долгое время не обращаются на прием к специалисту.

Изменения ногтей (уродливые, крошатся, истонченные) расцениваются как «ониходистрофии» после ушиба, отморожений и др. В то же время (даже изолированные поражения, в т.ч.ногтей) могут вести к формированию аллергической перестройки организма, влиять на кровеносные и лимфатические сосуды и др. Больные при этом неопределенно долго остаются источником распространения грибковой инфекции. В связи со сказанным неизменно актуальной является своевременная лабораторная диагностика микозов, проведение возможно раннего лечения.

Разнообразие клинических вариантов грибковых заболеваний, преимущественно встречающихся у человека, а также особенности микробиологии, морфоструктуры, иммунологических и иных параметров различных видов(и родов) грибов обусловило наличие значительного количества методов диагностики микозов; следует отметить, что имеющиеся методы непрерывно совершенствуются и (сравнительно недавно) имеют своеобразный уклон в сторону иммунологических и молекулярно-генетических тестов.

С другой стороны, культуральные исследования и до сих пор «находятся в разряде стандартов, близких к золотым» и применяются для подтверждения сомнительных результатов иных исследований; существует мнение, что сочетание культурального и молекулярно-генетического методов при «сомнительных» в диагностическом плане формах микозов (особенно диссеминированных, на фоне иммуносупрессии любого генеза, с поражением внутренних органов и др.) является одним из наиболее достоверных способов регистрации микотической природы процесса.

Не следует, однако, пренебрегать «старыми» методиками, в частности бактериоскопией (особенно припервичном обследовании), тем более, что в повседневной практике микроскопическая «верификация» микоза во многих дерматологических учреждениях применяется наиболее широко в сравнении с иными тестами.

С учетом значительного роста количества аллергических проявлений на коже (а иногда и висцеральных) — при длительном, хроническом, периодически обостряющемся течении микоза (кожи, ногтей и др.) целесообразна постановка аллергологических тестов, позволяющих выявить степень сенсибилизации организма, в т.ч, при сочетанной грибково-бактериальной инфекции; данный факт может повлиять на специфику лечения у конкретного больного — например, определить рациональное назначение антимикотиков и десенсибилизирующих средств и др.

Традиционно, предположительный диагноз грибкового заболевания ставится на основании клинических проявлений и подтверждается лабораторными исследованиями.

В данном разделе книги мы кратко приводим базовые методы регистрации микозов (независимо от их локализации), учитывая «тип исследования и взятый материал». Следует отметить, что полиморфизм клинических проявлений микозов (в т.ч. с аллергическим компонентом) обусловливает разнообразие патологического материала, подлежащего исследованию. При этом успех поиска элементов гриба зависит от правильного взятия его.

Так, периферическая зона эритемато-сквамозных, часто фигурных высыпаний более богата мицелием, спорами гриба; на волосистых участках поражения берутся скрюченные, белесоватые, обесцвеченные, тусклые волосы или их обломки — «пеньки» (забор волос целесообразно контролировать с помощью лампы Вуда). Определенных навыков требует забор материала (с помощью иглы) из т.н. «черных точек» — темных роговых конусов в устьях фолликулов.

В повседневной практике обычно исследуются чешуйки кожи(собираются путем соскоба, мазка, с использованием липкой ленты), соскоб измененных ногтей, зона подногтевого гиперкератоза, а также отделяемое слизистых оболочек. По показаниям исследуют мокроту, лаважную жидкость, мочу (у пациентов с некатетеризированным мочевым пузырем); моча из мочеприемников, подкладных суден не может быть взята для исследования.

Диагностическое значение имеет также кровь (для культурального исследования, а также ИФА, ПЦР), ликвор и иные биожидкости организма (плевральная, внутрисуставная, внутрибрюшинная — в т.ч. собранные методом аспирации или дренирования); в отдельных случаях (в зависимости от топического диагноза) имеют значение желчь, фекалии, пунктаты подкожных абсцессов, отделяемое свищей (особенно при глубоких микозах). Даже несложные диагностические тесты требуют точного соблюдения ряда условий.

Для диагностики грибковых заболеваний в настоящее время применяются методы:
- микроскопия; основана на обнаружении возбудителя в исследуемом материале, в т.ч. в тканях человека;
- культуральное исследование с последующим микроскопическим изучением культуры гриба;
- гистологическое исследование (г.о. при глубоких микозах);
- иммунные и молекулярные методы.

Микроскопическая диагностика

Микроскопическая диагностика предполагает изучение неокрашенных (нативных) и окрашенных препаратов. Данный метод, как отмечалось, более всего распространен в дерматологической практике ввиду сравнительной несложности и дешевизны, но, с другой стороны, бывает недостаточно чувствительным, требует в части Случаев повторных анализов, подтверждения иными методиками.

Так, при исследовании неокрашенных препаратов помимо элементов гриба, можно обнаружить эпителиоциты, клетки крови,различные загрязнения из внешней среды, что затрудняет поиск возбудителя микоза, требует дополнительной «подготовки» материала — т.н. «просветления» его (мацерации), концентрирования, разведения и т.п.

Все же прямая микроскопия нативных препаратов позволяет достаточно быстро поставить диагноз микоза, определить, на какие питательные среды (при необходимости) следует засевать материал, существует мнение, что положительный результат ее может оставаться единственным лабораторным подтверждением микоза при отрицательном ответе в культуре (А.Ю.Сергеев, Ю.В.Сергеев, 2003).

Среди различных вариантов «просветления» препаратов наиболее распространенным является добавление к исследуемому материалу КОН или NаОН (чаще используется для обнаружения грибов в чешуйках кожи, волосах, а также ряда возбудителей глубоких микозов в мокроте, биоптатах).

Для мацерации измельченных и помещенных на предметное стекло чешуек проводится 10-20% раствором едкого натра (или калия) — 1-3 капли, в течение 10-20 мин; препарат слегка придавливают покровным стеклом, для более скорой мацерации — подогревают на пламени до появления паров. Просмотр ведут сначала под малым увеличением, затем — под большим (сухая система).

Правильно приготовленный препарат, не подвергшийся грубым механическим, термическим и химическим воздействиям, представляет картину гомогенной массы, состоящей из эпителиоцитов, продуктов клеточного распада элементов гриба — нитей мицелия и спор.

Измененные волосы помещают на предметное стекло с 10-30% щелочью и обрабатывают тем же способом, но более длительно - от 20 мин до 3-4 ч. При обильном содержании пигмента рекомендуют предварительно обесцветить волосы 5% раствором перекиси водорода. Придают значение обнаружению элементов гриба, а также расположению их по отношению к волосу.

Подготовка материала из патологически измененных ногтей (лучше тонкий порошок, полученный соскобом из глубины очага) проводится аналогично, но с использованием 30% едкого натра, обязательным осторожным подогреванием на пламени до легких паров и экспозицией около 1ч (иногда до нескольких часов). Обработанные щелочью препараты не следует хранить более 1,5-2ч ввиду их «порчи» (кристаллизация реагента, снижение диагностической достоверности определяемой микроскопической картиной).

Вместо КОН или №ОН можно использовать: а)раствор смесь КОН с 15% ДМСО; б) смесь фенола (2 части) с хлоралгидратом (2 части) и молочной кислотой (1 часть); в) калькофлюоровый белый, имеющий сродства к хиги-ну и целлюлозе; для исследования необходим люминесцентный микроскоп (наблюдается голубое или зеленое свечение, что зависит от применяющегося фильтра). При исследовании ликвора (при подозрении на криптококкоз) часто использовалась окраска с тушью.

Кулага В.В., Романенко И.М., Афонин С.Л., Кулага С.М.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МИКОЗОВ

Взятие материала для лабораторного исследования на грибок.

1.ОСТ 42-21-2-854: приказ № 222/80 от 27.06.00
2.Оснащение: пинцет, предметные стекла, ножницы, ложка фолькмана.
4.Показания: грибковые заболевания.
5.Осложнения: нет.

Подготовка процедурного кабинета:

Смена растворов.

Приготовить:
-1%р-р хлорамина для ветоши
-3%р-р хлорамина – для дезинфекции перевязочного материала и пинцетов
- моющий р-р (156 мл. перекиси водорода + 5 г. моющего порошка + 839 мл. дисцилированной воды) - для обработки пинцетов
- 6% р-р перекиси водорода – для обработки перчаток.

Алгоритм выполнения манипуляции.

Нужно взять пинцет, предметное стекло, ложку фолькмана, ножницы;
- пациента пригласить в перевязочную;
- пациент сидит на стуле или кушетке;
- м/с стоит.

Техника выполнения:

Из очага поражения пинцетом взять чешуйки кожи и волосы;
- взятый материал положить на предметное стекло и закрыть другим предметным стеклом.
- вымыть руки с мылом;
- взятый материал отправить в лабораторию.

СБОР МАТЕРИАЛА

Взять ножницы и предметные стекла;
- ножницами отрезать кусочек от свободного края ногтя;
- взятый материал покрыть другим предметным стеклом;

Ножницы и пинцет замочить в 3% растворе формалина.

Правильный сбор материала из пораженных ногтей - залог успешного микробиологического исследования. Забирая материал, не всегда захватывают участки ногтя, содержащие жизнеспособные грибы. Нежизнеспособные грибы в культуре, естественно, не вырастут, и их вид установить не удастся.

Участок ногтя, который надо взять, определяется формой онихомикоза.

Так, при поверхностной форме онихомикоза следует делать соскобы с поверхности ногтевой пластинки.

При самой распространенной дистальной подногтевой форме наиболее жизнеспособные грибы располагаются под ногтевой пластинкой. Материал, который направляют на исследование, должен включать не только обрезок ногтевой пластинки, но и соскоб с ногтевого ложа, из-под пластинки.

Кроме того, следует захватывать и области неизмененного ногтя, поскольку на границе между ними и пораженными участками ногтя располагаются самые активные грибы.

При проксимальной подногтевой форме брать материал трудно. В этих случаях иногда, особенно если собираются проводить гистологическое исследование или дифференциальную диагностику, предпринимают биопсию ногтя, изредка используют бормашину.

При паронихиях делают соскобы с проксимального валика и из-под него.

Во всех случаях, чтобы избежать бактериальной контаминации, перед взятием образца следует обработать ноготь этиловым спиртом.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах.

Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.

На размягченные чешуйки кожи или ногтя, которые помещают на середину предметного стекла, наносят 1-3 капли 20 - 30% раствора КОН (NaOH). Исследуемый материал в каплях щелочи осторожно подогревают над пламенем спиртовки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли. Подогревать до кипячения не следует. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха.

Р. А. Аравийский и Г. И. Горшкова (1995) рекомендуют просветленные и накрытые покровным стеклом препараты кожных чешуек и волос оставлять на 5 - 10 мин, а ногтевых пластинок – на 30 - 40 мин до микроскопирования.

Просветление препаратов можно проводить без подогревания, для этого их оставляют в 20% растворе КОН на 30 - 60 мин или используют другие методы просветления патологического материала: хлораллактофенолом по Аману; лактофенолом; раствором, содержащим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде. Хорошие результаты получают после просветления ногтевых пластинок, помещенных в 5% раствор КОН на 24 ч, подогревания в этом случае не требуется.

Микроскопическое исследование производят на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии.

Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена. В начале препарат находят на стекле при малом увеличении (40х), последующее исследование производят при большем увеличении (100х);

детально препарат изучают при увеличении 400х. Необходимо исследовать несколько препаратов с тем, чтобы увеличить надежность анализа и избежать ложноположительных результатов.

Ошибки в микроскопической диагностике грибов могут возникнуть в связи как с дефектами приготовления препарата, так и с недостаточной опытностью лаборанта.

Дефекты изготовления прежде всего бывают связаны:
с перегреванием препарата, что может привести к выпадению кристаллов щелочи, разрушению волоса и появлению мелкозернистого распада в патологическом материале.

Линейное расположение удлиненных ровных кристаллов щелочи весьма напоминает нити септированного мицелия даже на чистом стекле без патологического материала.

Дифференциально-диагностическими признаками являются исключительное однообразие кристаллов, их стекловидная прозрачность, многогранность краев и отсутствие неразрывной связи одного элемента с другим. В сомнительных случаях рекомендуется добавить к препарату капельки слегка подогретой дистиллированной воды, которые быстро растворяют кристаллы щелочи.

За элементы гриба ошибочно могут быть приняты:

- капельки жира,
- пузырьки воздуха,
- хлопчатобумажные нити одежды
- и так называемый «мозаичный грибок».

Липиды кожных покровов, жировой распад клеток и зерна кератогиалина, особенно имеющие правильную форму, могут напоминать отдельные споры гриба. Но разнообразие формы и, главное, размеров, отсутствие внутренней структуры образований (вакуоли, оболочки) говорят против грибковой природы данных элементов. Липиды также могут попасть в препарат при взятии патологического материала с недостаточно очищенного очага поражения.

Пузырьки воздуха могут напоминать споры дрожжеподобных клеток, но в отличие от последних они окружены плотной темной оболочкой, и даже самые маленькие пузырьки воздуха всегда больше клеток гриба.

Нити от ткани носков, одежды и т. п. обычно лежат отдельно от патологического материала, они всегда больше гифов, грубее и не септированы.

«Мозаичный грибок» представляет собой артефакт, который возникает в процессе кристаллизации (возможно, за счет распада холестерина). Он имеет вид сеточки или петель, очертания которых соответствуют границам роговых чешуек, в отличие от нитей мицелия он никогда не пересекает стенки клеток эпидермиса.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раствором КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих темно-синих чернил фирмы Паркер (Parker"s Superchrome Blue-Black Ink).

При этой окраске гифы и споры окрашиваются в голубой цвет.

При микроскопии обнаруживают нитевидные гифы грибов или почкующиеся клетки (рис.1).

Таким образом, микроскопия дает заключение только о грибковой природе инфекции, но не о виде гриба-возбудителя.

Конечно, результативность микроскопического исследования зависит от квалификации сотрудника лаборатории.

Рис. 1. Микроскопия соскоба с ногтей, пораженных Т. rubrum. Видны гифы гриба.

КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Проводят посев материала на стандартную среду Сабуро, часто с добавками антибиотиков. В диагностике дерматофитных инфекций принято добавлять в среду Сабуро циклогексимид, подавляющий рост грибов-контаминантов, попадающих из воздуха. Существуют готовые коммерческие среды с добавками антибиотиков и циклогексимида. Следует помнить, что многие плесневые грибы-недерматофиты и некоторые виды Candida не растут на среде с циклогексимидом, поэтому рекомендуется делать посев на среду Сабуро с циклогексимидом и на среду без него. Идентификацию видов обычно проводят при микроскопическом исследовании выросшей культуры или путем пересева на селективные среды (рис. 2-15).

Рис. 2. Культура гриба Т. rubrum, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро (слева) и кукурузном агаре (справа).

Рис. 3. Культура гриба Т. mentagrophytes var. interdigitale, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 4. Культура гриба Candida albicans. Получена на среде Сабуро.

Рис. 5. Культура гриба Torulopsis glabrata, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 6. Культура гриба Ulocladium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 7. Микроморфология Acremonium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 8. Микроморфология Fusarium sp., вьщеленного из пораженных ногтей.

Рис. 9. Микроморфология Scopulariopsis sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 10. Микроморфология Candida albicans, выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 11. Микроморфология Altemaria sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 12. Микроморфология Aspergillus sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 13. Микроморфология Ulocladium sp , выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 14. Микроморфология Chaetomium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис 15. Панель питательных фед для идентификации дерматофитов (слева - культура Т rubrum, справа - Т mentagrophytes var. mterdigitale).

Слева направо: среда Сабуро, среда Бакстера, среда Христенсена, кукурузный агар

Следует учесть, что некоторые плесневые грибы, в том числе дерматофиты, в культуре вырастают медленно, за 2-3 нед.

Даже при соблюдении всех правил сбора материала, при хорошем оборудовании лаборатории и высокой квалификации ее персонала число положительных результатов культурального исследования очень невелико.

По данным зарубежной литературы, процент положительных исследований не превышает 50.
Процент положительных результатов в лучших отечественных лабораториях едва достигает 30.

Таким образом, в 2 из каждых 3 случаев онихомикоза его этиологию установить не удается.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

В 1925 г. Margaret и Deveze обнаружили, что волосы, пораженные некоторыми дерматофитами, дают характерное свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Byда. Стекло Byда состоит из сульфата бария, содержит около 9% окиси никеля; оно пропускает лучи длиной 365 нм. В качестве источника ультрафиолетовых лучей можно использовать различные приборы. Природа свечения точно не установлена. Волос продолжает светиться после гибели гриба и после попыток экстрагировать флюоресцирующий материал горячей водой или холодным раствором бромида натрия. Интенсивность и характер свечения зависят от рН раствора. Полагают, что флюоресцирующая субстанция появляется в процессе взаимодействия гриба и растущего волоса.

Свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Вуда, характерно только для волос, пораженных грибами рода Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, изредка M. gypseum и M. nanum), a также Trichophyton schonleinii. Волосы, пораженные микроспорумами, особенно M. canis и M. audouinii, дают наиболее яркое свечение; волосы, пораженные Т. schonleinii, имеют тусклую зеленоватую флюоресценцию.

Свечение наблюдается только в полностью пораженных грибом волосах. Его может не быть в свежих очагах поражения. В этих случаях следует эпилировать волосы из краевой, наиболее активной зоны, и свечение можно обнаружить в корневой части волос.

Люминесцентный метод можно использовать как для диагностики и контроля за эффективностью лечения у отдельных больных, так и в эпидемиологических очагах. Компактные передвижные установки удобны для обследования контактных людей в школах, детских садах и т. п.

Люминесцентное обследование необходимо производить в затемненной комнате, очаги поражения должны быть предварительно очищены от корок, остатков мази и т. п. Люминесцентный метод можно использовать для диагностики отрубевидного лишая, особенно при локализации очагов поражения на волосистой части головы. Очаги поражения при этом заболевании имеют красновато-желтое или бурое свечение. Это свечение, однако, не является строго специфичным, так как может наблюдаться при наличии перхоти на волосистой части головы и даже у здоровых людей в области устьев волосяных фолликулов на лице и верхней части туловища. Выявленные с помощью люминесцентного метода пораженные волосы должны обязательно подвергаться микроскопическому исследованию.

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний. Для обнаружения специфических антител в сыворотке пробы проводят следующие серологические реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции с соответствующими антигенами.

Аллергическое состояние организма больного выявляют с помощью аллергических кожных проб. Аллергены наносят на скарифицированную кожу по Пирке или втиранием в кожу по Моро, внутрикожно по Манту, а также уколом в кожу. С помощью этих проб выявляют аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, что позволяет оценить состояние гуморального и клеточного иммунитета.

Для выявления специфической сенсибилизации лимфоцитов используют реакции дегрануляции базофилов, агломерации и альтерации, тест бластной трансформации, подавления миграции макрофагов и т. п.

Сопоставление результатов серологических и аллергических реакций оказывается полезным как для диагностики, так и для прогноза течения микозов.

Биологический метод. Используется для лабораторной диагностики глубоких и особо опасных микозов. Основан на заражении животных патологическим материалом от больного или культурой исследуемого гриба. Осуществляется в специальных лабораториях.

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Гистология микозов кожи, обусловленных дерматофитами

Патоморфологические изменения в очагах поражения обусловлены внедрением грибов в роговой слой эпидермиса, волосы и ногти и ответной воспалительной реакцией кожи, которая может быть острой, подострой или хронической. Диагноз можно считать установленным только в том случае, если в гистологических препаратах обнаруживают элементы грибов. Для этого используют различные гистологические окраски, наиболее информативной является периодическая кислотная реакция (PAS), позволяющая выявить полисахариды, имеющиеся в целлюлозе и хитине клеточной стенки большинства дерматофитов (окраска по Шифу и ее модификации). Можно также использовать реакции сульфатирования и импрегнацию гистологических срезов серебром [Хмельницкий О. К., 1973; Lewer W. F. и Schaumburg-Lewerl.,1983].

Грибы в роговом слое эпидермиса, даже при использовании специальных окрасок, выявляются в небольшом количестве в виде нитей мицелия и спор. В редких случаях, когда грибов в очагах поражения много, их можно обнаружить в срезах, окрашенных гемотоксилин-эозином, в виде нежных базофильных структур в роговом слое.

Воспалительные изменения в эпидермисе могут быть различными: от незначительного внутри- и внеклеточного отека шиповатых клеток до выраженного спонгиоза. Спонгиоз обычно развивается при дисгидротических вариантах микозов стоп и кистей, клинически в этих случаях отмечаются пузырьки. Причиной этой реакции обычно является Т. mentagrophytes var. interdigitale. Иногда в эпидермисе отмечается выраженный гиперкератоз, что чаще всего наблюдается при микозе, обусловленном Т. rubrum.

Гистологические изменения в дерме неспецифичны и соответствуют острому, подострому и хроническому воспалению.

При микозе гладкой кожи, вызванном Т. rubrum, грибы иногда выявляются в пушковых волосах и волосяных фолликулах. Вокруг фолликулов развивается воспалительная реакция, которая за счет попадания в дерму грибов может приобретать гранулематозный характер. Центральная часть инфильтрата в этих случаях может подвергаться нагноению и некрозу, а периферическая состоять из лимфоцитов, гистоцитов, эпителиоидных и многоядерных гигантских клеток, внутри которых иногда обнаруживаются споры гриба. Размеры спор здесь достигают 6 мкм в диаметре, в волосе обычно не превышают 2 мкм.

При инфильтративно-нагноительной форме микозов волосистой части головы и области роста бороды и усов элементы грибов обнаруживаются в волосяном фолликуле, внутри и вокруг волоса. В волосе они определяются чуть выше зоны начала кератинизации (примерно на уровне 30 мкм). В дерме отмечают воспалительную реакцию различной интенсив­ности, наиболее выраженную при kerion Celsii. При острой гнойной реакции в составе инфильтрата отмечают большое количество нейтрофильных лейкоцитов, элементы грибов в этом случае могут полностью исчезать. При хроническом те­чении процесса инфильтрат может приобретать гранулематозный характер, в нем появляются многоядерные гигантские клетки. Для подтверждения диагноза при отсутствии в инфильтрате грибов можно использовать иммунофлюоресцентные методы окраски. Для этих целей применяют меченную флюоресцином антисыворотку к Т. mentagrophytes, которая позволяет обнаружить антигены гриба в волосе и в перифолликулярном инфильтрате.

Формирование инфильтративно-нагноительной реакции кожи при микозе волосистой части головы (kerion Celsii) и области роста бороды и усов, обусловленных грибами М. саnis, Т. tonsurans и Т. verrucosum, представляет собой проявле­ние иммунологической реакции. Об этом свидетельствуют:

1. Склонность очагов поражения к спонтанному разрешению.

2. Отсутствие элементов гриба при очень выраженной воспалительной реакции со стороны кожи при микозе, вызванном Т. verrucosum (faviforme) и Т. tonsurans.

3. Постоянная положительная реакция в ответ на внутрикожное введение трихофитина при инфильтративно-нагноительных формах микоза, вызванного зоофильными трихофитинами (например, Т. tonsurans), и отрицательная - при поверхностных микозах, обусловленных тем же Т. tonsurans.

При фавусе в роговом слое эпидермиса обнаруживается большое количество нитей мицелия и единичные споры гриба. Скутула представлена экссудатом, паракератотическими клетками эпидермиса, клетками воспалительного инфильтрата, а также нитями мицелия и спорами гриба, которые расположены преимущественно в периферической зоне скутулы. В активной стадии болезни в дерме вокруг дегенеративных волосяных фолликулов отмечается выраженный воспалительный инфильтрат, содержащий многоядерные гигантские и плазматические клетки. В старых очагах поражения волосы и сальные железы отсутствуют, имеются явления фиброза.

Гистология микозов кожи и слизистых оболочек, обусловленных дрожжеподобными грибами

При кандидозе кожи и слизистых оболочек грибы рода Candida обнаруживаются в роговом слое эпидермиса или в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки. Элементов гриба обычно мало, они хорошо окрашиваются PAS-peакцией или по Граму; представлены в виде нитей септированного ветвящегося мицелия, размером 2-4 мкм в диаметре, или овоидными спорами, размером 3 - 5мкм в диаметре. Диагностическое значение имеет обнаружение мицелиальной формы гриба.

При гистологическом исследовании хронического гранулематозного кандидоза кожи и слизистых оболочек элементы гриба также преимущественно обнаруживают в роговом слое эпидермиса или в самых верхних отделах эпителия слизистой оболочки, но иногда в шиповатом слое, внутри волоса и в дерме. Отмечается также выраженный гиперкератоз и папилломатоз; в дерме – густой воспалительный инфильтрат, состоящий из лимфоидных клеток, нейтрофилов, плазматических и многоядерных гигантских клеток. Инфильтрат может распространяться в подкожную жировую клетчатку.

При отрубевидном лишае в роговом слое эпидермиса обнаруживают большое количество элементов гриба в виде нежных базофильных структур, которые хорошо видны даже при окраске препаратов гемотоксилин-эозином. Грибы представлены как нитями, так и спорами.

При фолликулярной форме отрубевидного лишая отмечается скопление роговых масс и клеток воспалительного инфильтрата в расширенных устьях волосяных фолликулов. Вокруг фолликулов также отмечают воспалительный инфильтрат. При PAS-реакции сферические или овальные споры гриба, размером 2-4 мкм в диаметре, обнаруживают внутри устья волосяных фолликулов, а иногда в перифолликулярном инфильтрате. Мицелий никогда не выявляется.

Нарушение пигментации кожи у больных отрубевидным лишаем обусловлено способностью гриба Pityrosporum вырабатывать субстанцию, которая угнетает процесс пигментообразования в эпидермисе. Электронно-микроскопическое изучение биоптатов кожи с гипопигментированных участков показало, что в меланоцитах образуются очень маленькие меланосомы, которые не способны проникать в кератиноциты. В гиперпигментированных участках кожи, наоборот, меланосомы крупные и содержат большое количество меланина.