A. A. Тарасов

Мишени воздействия и зависимости между структурой и активностью антибиотиков

Институт кибернетики им. Глушкова НАН Украины,
Харьковский институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова

Для выяснения механизмов действия лекарств на молекулярном уровне необходимо выявить минимальные условия узнавания как основу понимания того, как разнообразный набор химических структуp может активировать один и тот же рецептор. Молекулярное узнавание решающим образом зависит от трехмерного распределения электронной плотности в молекуле, и логической целью попыток вывести условия узнавания является определение конформации лекарства в комплексе с рецептором. Ниже на примере хорошо известных антибиотиков - производных триметоприма и b-лактамных препаратов - кратко затронуты вопросы, в какой степени понятна сейчас связь между структурой и активностью на уровне молекулярных мишеней взаимодействия и как зависимости активности от структурных особенностей могут быть использованы для конструирования перспективных противомикробных препаратов.

Антимикробная активность всех беталактамов обусловлена двумя обстоятельствами: высокой реакционной способностью беталактамного кольца - при его раскрытии ацилируются ОН- или NH- группы, и сходством консервативной части молекулы беталактамного антибиотика с одним из переходных состоянии конформации D-аланил-D-аланинового фрагмента пептидных цепочек пептидогликана, попадающего в активный центр транспептидаз и D-аланинкарбоксипептидаз. Все внедренные в клинику беталактамы подавляют синтез пептидогликана за счет инактавации транспептидаз, участвующих в синтезе полимера. Однако множественность этих ферментов обуславливает и множественность мишеней для беталактамов в структурах. Среди энзимов - объектов воздействия триметоприма и b-лактамных препаратов - пространственная структура изучена только у двух: дигидрофолатредуктазы кишечной палочки и карбоксипептидазы/тpaнcпeптидазы Streptomices R 61 (Cpase/TRase S. R 61). Наибольший прогресс достигнут в изучении пространственной структуры дигидрофолатредуктазы, являющейся объектом воздействия триметоприма, что находит теперь практическое применение и при конструировании лекарств. Сравнительно хорошо проанализирована также и структура мишеней воздействия b-лактамных препаратов. Среди них в качестве модельного энзима подробно изучена карбоксипептидаза/транспептидаза Streptomices R 61. В качестве энзимов, вступающих в реакцию с b-лактамом, кроме карбоксипептидазы/транспептидазы, известна также b-лактамаза. Все эти энзимы имеют в активном центре серин. Третьим от серина вдоль аминокислотной цепи всегда следует лизин, во многих случаях за лизином следует фенилаланин. Сходный характер первичной структуры является также общим для многих пенициллинсвязывающих белков, что дает основание предположить генетическую общность энзимов, вступающих в реакцию с b-лактамом.

Следует отметить, что энзим карбоксилпептидаза/транспептидаза Streptomiсes R 61 является производимым вне клетки растворимым белком, который сравнительно легко кристаллизуется и потому может быть исследован с помощью рентгеноструктурного анализа. Однако этот энзим является модельной системой, а не подлинной мишенью, подлежащей уничтожению b-лактамным препаратом. Подлинные же энзимы - объекты воздействия b-лактамных препаратов - ввиду их низкой растворимости и большой молекулярной массы, пока не удается закристаллизовать, а следовательно и расшифровать их с помощью рентгеноструктурного анализа. Таким образом, прямые экспериментальные исследования структуры мишеней воздействия антибиотиков пока что крайне ограничены. Отсутствие детальных данных о пространственной структуре молекулярных мишеней существенно сдерживает процесс выявления зависимостей структура-активность и последующее конструирование лекарств. В этой ситуаций возрастает роль исследований структуры мишеней путем воздействия на них ряда химических соединений известной структуры и последующего анализа связей структура-уровень бактерицидного действия. Выявление таких связей позволяет составить определенное представление о структуре мишеней и, основываясь на такой гипотетической модели структуры мишени, осуществить синтез перспективных лекарственных средств.

Активность антибиотиков почти во всех случаях измеряется величиной бактерицидного действия, а именно - минимальной ингибирующей концентрацией - МИК (или МІС). Этот показатель зависит не только от способности препарата воздействовать на мишень, но также и от влияния таких факторов, как проницаемость мембраны для препарата, его активация ферментами и др. При осуществлении поиска эффективных лекарственных препаратов МИК имеет первостепенное значение. Однако для того, чтобы по силе бактерицидного действия можно было судить об эффективности воздействия антибиотика непосредственно на мишень (то есть о воздействии как акте бимолекулярного узнавания); влияние барьера проницаемости и инактивирующих ферментов должно быть учтено. Действительно, как показали сравнительные исследования зависимостей между сродством b-лактамных препаратов с ПСБ и величиной их бактерицидного действия в отношении обычного штамма Е. соli (штамм LD 2) и штамма мутанта (штамм PG 12), лишенного b-лактамазы и барьера проницаемости, в первом случае имела место слабая корреляция (r = 0,613) между МИК и І50 (концентрацией, обеспечивающей 50-процентное ингибирование ПСБ 1, 2 и 3), тогда как во втором случае, у штамма PG 12, взаимосвязь этих параметров оказалась очень сильной: коэффициент корреляции r составил 0,941 (рис. 1). Обращает на себя внимание интересный факт, иллюстрируемый последней зависимостью. Как известно, цефалоспорины подвергались постоянному улучшению путем модификации его химической структуры, и теперь имеется несколько поколений этого препарата. Если рассматривать этот процесс с точки зрения сродства препарата к ПСБ, то оказывается, что сродство цефазолина, представителя первого поколения, относительно низко (показатель І50 составляет около 1 мкг/мл). У препаратов второго поколения, например, у цефуроксима, сродство на порядок выше. Что касается препаратов третьего поколения (например цефотаксим), то их сродство еще на порядок выше. Таким образом, усиление бактерицидного действия препаратов цефалоспоринового ряда в отношении грамотрицательных бактерий вызывается повышением сродства к ПСБ - параметра, отражающего именно структурные особенности, необходимые для эффективного молекулярного взаимодействия. А значит сила бактерицидного действия в общем может быть объяснена ингибированием ПСБ. Однако детальное содержание этого взаимодействия на молекулярном уровне все еще остается не выясненным. Можно полагать, что, благодаря прогрессу в области генной инженерии, гены, отвечающие за синтез ПСБ, станет возможным подвергать клонированию и что отдельные из ПСБ удастся закристаллизовать. Тот факт, что была осуществлена кристаллизация ПСБ 1В кишечной палочки - белка с молекулярной массой около 90 000 - дает основания рассчитывать на дальнейший прогресс в этой области. Можно ожидать, что и рентгеноструктурный анализ белковых структур, благодаря совершенствованию методов расшифровки и распространению суперкомпьютеров, значительно ускорится.

Фармакодинамика - раздел клинической фармакологии, изучающий механизмы действия, характер, силу и длительность фармакологических эффектов ЛС, используемых в клинической практике.

Пути воздействия ЛС на организм человека

Большинство ЛС, связываясь с рецепторами или другими молекулами-мишенями, образуют комплекс «ЛС-рецептор», при этом происходит запуск определённых физиологических или биохимических процессов (или количественное их изменение) в организме человека. В таком случае говорят о прямом действии ЛС. Структура ЛС прямого действия, как правило, аналогична строению эндогенного медиатора (однако при взаимодействии ЛС и медиатора с рецептором нередко регистрируют различные эффекты).

Группы лекарственных средств

Для удобства примем величину эффекта эндогенного медиатора, связывающегося с рецептором, равной единице. Существует классификация ЛС, созданная на основе данного предположения.

Агонисты - ЛС, связывающиеся с теми же рецепторами, что и эндогенные медиаторы. Агонисты производят эффект, равный единице (или больше единицы).

Антагонисты - ЛС, соединяющиеся с теми же рецепторами, что и эндогенные медиаторы; не оказывают никакого действия (в таком случае говорят о «нулевом эффекте»).

Частичные агонисты или агонисты-антагонисты - ЛС, связывающиеся с тем же рецепторами, что и эндогенные медиаторы. Эффект, регистрируемый при взаимодействии частичного агониста с рецептором, всегда больше нуля, но меньше единицы.

Все естественные медиаторы - агонисты своих рецепторов.

Нередко отмечают опосредованное действие, заключающееся в изменении активности молекул-мишеней под влиянием ЛС (воздействует таким образом на различные метаболические процессы).

Молекулы-мишени ЛС

ЛС, связываясь с молекулой-мишенью, принадлежащей клетке (или расположенной внеклеточно), модифицирует её функциональный статус, приводя к усилению, ослаблению или стабилизации филогенетически детерминированных реакций организма.

Рецепторы.

- Мембранные (рецепторы I, II и III типов).

- Внутриклеточные (рецепторы IV типа).

Нерецепторные молекулы-мишени цитоплазматической мембраны.

- Цитоплазматические ионные каналы.

- Неспецифические белки и липиды цитоплазматической мембраны.

Иммуноглобулиновые молекулы-мишени.

Ферменты.

Неорганические соединения (например, соляная кислота и металлы).

Молекулы-мишени обладают комплементарностью к эндогенным медиаторам и соответствующим ЛС, заключающейся в определён- ном пространственном расположении ионных, гидрофобных, нуклеофильных или электрофильных функциональных групп. Многие ЛС (антигистаминные препараты I поколения, трициклические антидепрессанты и некоторые другие) могут связываться с морфологически близкими, но функционально отличающимися молекуламимишенями.

Виды связей лекарственных средств с молекулами-мишенями

Самые слабые связи между ЛС и молекулой-мишенью - ван-дерваальсовые связи, обусловленные дипольными взаимодействиями; наиболее часто определяют специфичность взаимодействия препарата и молекулы-мишени. Гидрофобные связи, характерные для ЛС стероидной структуры, более сильные. Гидрофобные свойства глюкокортикостероидных гормонов и липидного бислоя плазматической мембраны позволяют таким ЛС легко проникать через цитоплазматическую и внутриклеточную мембраны внутрь клетки и ядра к своим рецепторам. Ещё более сильные водородные связи образуются между атомами водорода и кислорода соседних молекул. Водородные и вандер-ваальсовые связи возникают при наличии комплементарности ЛС и молекул-мишеней (например, между агонистом или антагонистом и рецептором). Их сила достаточна для образования комплекса ЛС-ре- цептор.

Наиболее сильные связи - ионные и ковалентные. Ионные связи формируются, как правило, между ионами металлов и остатками сильных кислот (антациды) при поляризации. При соединении ЛС и рецептора возникают необратимые ковалентные связи. Антагонис-

ты необратимого действия связываются с рецепторами ковалентно. Большое значение имеет образование координационных ковалентных связей. Стабильные хелатные комплексы (например, соединение ЛС и его антидота - унитиола* с дигоксином) - простая модель координационной ковалентной связи. При формировании ковалентной связи обычно происходит «выключение» молекулы-мишени. Этим объясняют формирование стойкого фармакологического эффекта (антиагрегантный эффект ацетилсалициловой кислоты - результат её необратимого взаимодействия с циклооксигеназой тромбоцитов), а также развитие некоторых побочных эффектов (ульцерогенное влияние ацетилсалициловой кислоты - следствие образования неразрывной связи между данным лекарственным веществом и циклооксигеназой клеток слизистой оболочки желудка).

Нерецепторные молекулы-мишени плазматической мембраны

Препараты, используемые для ингаляционного наркоза - пример ЛС, связывающихся с нерецепторными молекулами-мишенями плазматической мембраны. Средства для ингаляционного наркоза (галотан, энфлуран*) неспецифически соединяются с белками (ионными каналами) и липидами плазматической мембраны центральных нейронов. Существует мнение, что в результате такого связывания препараты нарушают проводимость ионных каналов (в том числе натриевых), приводя к увеличению порога потенциала действия и уменьшению частоты его возникновения. Средства для ингаляционного наркоза, соединяясь с элементами мембран центральных нейронов, вызывают обратимое изменение их упорядоченной структуры. Данный факт под- тверждён экспериментальными исследованиями: анестезированные животные быстро выходят из состояния общего наркоза при помещении их в гипербарическую камеру, где происходит восстановление мембранных нарушений.

Нерецепторные плазматические структуры (потенциал-зависимые натриевые каналы) также выполняют функции молекул-мишеней местных анестетиков. ЛС, связываясь с потенциал-зависимыми натриевыми каналами аксонов и центральных нейронов, блокируют каналы, и, таким образом, нарушают их проводимость для ионов натрия. В результате происходит нарушение деполяризации клетки. Терапевтические дозы местных анестетиков блокируют проводимость периферических нервов, а токсические их количества угнетают и центральные нейроны.

У некоторых ЛС отсутствуют свои молекулы-мишени. Однако такие препараты выполняют функцию субстратов для многих метаболических реакций. Существует понятие «субстратного действия» ЛС:

их применяют для восполнения недостатка различных необходимых организму субстратов (например, аминокислоты, витамины, витаминно-минеральные комплексы и глюкоза).

Рецепторы

Рецепторы - белковые макромолекулы или полипептиды, нередко соединённые с полисахаридными ветвями и остатками жирных кислот (гликопротеины, липопротеины). Каждое ЛС можно сравнить с ключом, подходящим к своему замку - специфическому рецептору данного вещества. Однако только часть молекулы рецептора, называемая сайтом связывания, представляет «замочную скважину». ЛС, соединяясь с рецептором, потенцирует формирование в нём конформационных изменений, приводящих к функциональным изменениям других частей рецепторной молекулы.

Типичная схема работы рецепторов включает четыре этапа.

Связывание ЛС с рецептором, расположенным на клеточной поверхности (или внутриклеточно).

Образование комплекса ЛС-рецептор и, следовательно, изменение конформации рецептора.

Передача сигнала от комплекса ЛС-рецептор к клетке через различные эффекторные системы, многократно усиливающие и интерпретирующие этот сигнал.

Клеточный ответ (быстрый и отсроченный).

Выделяют четыре фармакологически значимых типа рецепторов

Рецепторы - ионные каналы.

Рецепторы, сопряжённые с G-белками.

Рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью.

Внутриклеточные рецепторы. Мембранные рецепторы

Рецепторы I, II и III типов встроены в плазматическую мембрану - трансмембранные белки по отношению к клеточной мембране. Рецепторы IV типа расположены внутриклеточно - в ядре и других субклеточных структурах. Кроме того, выделяют иммуноглобулиновые рецепторы, представляющие гликопротеиновые макромолекулы.

Рецепторы I типа имеют вид и строение ионных каналов, обладают сайтами связывания со специфическим ЛС или медиатором, индуцирующим открытие ионного канала, образованного рецептором. Один из представителей I типа рецепторов - N-холинорецептор - гликопротеин, состоящий из пяти трансмембранных полипептидных субъединиц. Выделяют четыре вида субъединиц - α, β, γ и δ тип. В состав гликопротеина входят по одной субъединице β, γ и δ типа и

две α субъединицы. Трансмембранные полипептидные субъединицы имеют вид цилиндров, пронизывающих мембрану и окружающих узкий канал. Каждый тип субъединиц кодирует собственный ген (однако гены обладают значительной гомологией). Участки связывания ацетилхолина локализуются на «внеклеточных концах» α-субъединиц. При связывании ЛС с этими участками наблюдают конформационные изменения, приводящие к расширению канала и облегчению проводимости ионов натрия, а следовательно, к деполяризации клетки.

К I типу рецепторов, кроме N-холинорецептора, относят также ГАМК А -рецептор, глициновые и глутаматные рецепторы.

Рецепторы, сопряжённые с G-белками (II тип) - самая многочисленная группа рецепторов, обнаруженных в организме человека; выполняют важные функции. С рецепторами II типа связываются большинство нейромедиаторов, гормонов и ЛС. К наиболее распро- странённым клеточным рецепторам этого типа относят вазопрессиновые и ангиотензиновые, α-адренорецепторы, β-адренорецепторы и м-холинорецепторы, опиатные и дофаминовые, аденозиновые, гистаминовые и многие другие рецепторы. Все вышеперечисленные рецепторы - мишени ЛС, составляющих обширные фармакологические группы.

Каждый рецептор второго типа представляет полипептидную цепь с N-концом (расположен во внеклеточной среде) и С-концом (локализован в цитоплазме). При этом полипептидная цепь рецептора семь раз пронизывает плазматическую мембрану клетки (имеет семь трансмембранных сегментов). Таким образом, структуру рецептора II типа можно сравнить с нитью, поочерёдно прошивающей ткань с обеих сторон семь раз. Специфичность различных рецепторов второго типа зависит не только от аминокислотной последовательности, но и от длины и соотношения «петель», выпячивающихся наружу и внутрь клетки.

Рецепторы второго типа образуют комплексы с мембранными G-белками. G-белки состоят из трёх субъединиц: α, β и γ. После связывания рецептора с ЛС образуется комплекс ЛС-рецептор. Затем в рецепторе происходят конформационные изменения. G-белок, связываясь одной или двумя субъединицами со своими «мишенями», активирует или ингибирует их. Аденилатциклаза, фосфолипаза С, ионные каналы, циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ)-фосфодиэстераза - мишени G-белка. Как правило, активированные ферменты передают и усиливают «сигнал» через системы вторичных посредников.

Рецепторы с тирозинкиназной активностью

Рецепторы с тирозинкиназной активностью (III тип) - рецепторы пептидных гормонов, регулирующих рост, дифференцировку и

развитие. К пептидным гормонам относят, например, инсулин, эпидермальный фактор роста, фактор роста тромбоцитов. Как правило, связывание рецептора с гормоном активирует тирозиновую протеинкиназу, представляющую цитоплазматическую часть (домен) рецептора. Мишень протеинкиназы - рецептор, обладающий способностью к аутофосфорилированию. Каждый полипептидный рецептор имеет один трансмембранный сегмент (домен).

Однако, как показали исследования, не тирозиновая протеинкиназа, а гуанилатциклаза, катализирующая образование вторичного посредника цГМФ, выполняет функции цитоплазматического домена рецептора предсердного натрийуретического пептида.

Внутриклеточные рецепторы

К внутриклеточным рецепторам (IV тип) относят рецепторы глюкокортикостероидных и тиреоидных гормонов, а также рецепторы ретиноидов и витамина D. В состав группы внутриклеточных рецепторов входят рецепторы, не связанные с плазматической мембраной, локализованные внутри ядра клетки (это главное отличие).

Внутриклеточные рецепторы представляют растворимые ДНК-связывающие белки, регулирующие транскрипцию определённых генов. Каждый рецептор IV типа состоит из трёх доменов - гормон-связывающего, центрального и N-терминального (домен N-конца молекулы рецептора). Эти рецепторы качественно и количественно регулируют уровень транскрипции определённого «набора» генов, специфичного для каждого рецептора, а также вызывают модификацию биохимического и функционального статуса клетки и её метаболических процессов.

Эффекторные системы рецепторов

Существуют различные способы передачи сигналов, формирующихся в процессе функционирования рецепторов, клетке. Путь передачи сигнала зависит от типа рецептора (табл. 2-1).

Главные вторичные посредники - циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), ионы кальция, инозитолтрифосфат и диацилглицерол.

Иммуноглобулины (иммуноглобулиновые рецепторы)

С помощью иммуноглобулиновых рецепторов клетки имеют возможность «узнавать» друг друга или антигены. В результате взаимодействия рецепторов происходит адгезия клетки с клеткой или клетки с антигеном. К рецепторам этого типа относят и антитела, свободно циркулирующие во внеклеточных жидкостях и не связанные с клеточными структурами. Антитела, «маркируя» антигены для последующего фагоцитоза, отвечают за развитие гуморального иммунитета.

Таблица 2-1. Эффекторные системы рецепторов

Тип рецептора Пример рецептора Способы передачи сигналов

К типу иммуноглобулинов принадлежат рецепторы, выполняющие функцию «сигнализации» при формировании различных видов и фаз иммунного ответа и иммунной памяти.

Основные представители рецепторов иммуноглобулинового типа (суперсемейства).

Антитела - иммуноглобулины (Ig).

Т-клеточные рецепторы.

Гликопротеины МНС I и МНС II (Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости).

Гликопротеины клеточной адгезии (например, CD2, CD4 и CD8).

Некоторые полипептидные цепи комплекса CD3, ассоциированного с Т-клеточными рецепторами.

Fc-рецепторы, расположенные на различных типах лейкоцитов (лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы).

Функциональная и морфологическая обособленность иммуноглобулиновых рецепторов позволяет выделить их в отдельный тип.

Ферменты

Многие ЛС, связываясь с ферментами, обратимо или необратимо ингибируют или активируют их. Так, антихолинэстеразные средства усиливают действие ацетилхолина, блокируя расщепляющий его фермент - ацетилхолинэстеразу. Ингибиторы карбоангидразы - группа диуретиков, опосредованно (под влиянием карбоангидразы) уменьшающих реабсорбцию ионов натрия в проксимальных канальцах. НПВС - ингибиторы циклооксигеназы. Однако ацетилсалициловая кислота, в отличие от других НПВС, необратимо блокирует циклооксигеназу, ацетилируя остатки серина (аминокислота) в молекуле фермента. Существует два поколения ингибиторов моноаминоксидазы (МАО). Ингибиторы МАО - ЛС, относящиеся к группе антидепрессантов. Ингибиторы МАО первого поколения (например, фенелзин и изокарбоксазид) необратимо блокируют фермент, окисляющий такие моноамины, как, норадреналин* и серотонин (их недостаток обнаруживают при депрессии). Новое поколение ингибиторов МАО (например, моклобемид) обратимо ингибирует фермент; при этом отмечают меньшую выраженность побочных эффектов (в частности, «тираминового» синдрома).

Неорганические соединения

Существуют ЛС, направленно нейтрализующие или связывающие активные формы различных неорганических соединений. Так, антациды нейтрализуют избыток соляной кислоты желудочного сока, умень-

шая её повреждающее действие на слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки.

Хелатообразующие вещества (комплексоны), соединяясь с опре- делёнными металлами, образуют химически инертные комплексные соединения. Этот эффект используют при лечении отравлений, вызванных приёмом внутрь (или ингаляционно) веществ, содержащих различные металлы (мышьяк, свинец, железо, медь).

Молекулы-мишени, расположенные на чужеродных организмах

Механизмы действия антибактериальных, антипротозойных, антигельминтозных, противогрибковых и противовирусных ЛС очень разнообразны. Приём антибактериальных препаратов, как правило, приводит к нарушению различных этапов синтеза клеточной стенки бактерий (например, к синтезу дефектных белков или РНК в бактериальной клетке) или изменению других механизмов поддержания жизнедеятельности микроорганизма. Подавление или эрадикация возбудителя инфекции - главная цель лечения.

Механизм бактерицидного действия β-лактамных антибиотиков, гликопептидов и изониазида - блокада различных этапов синтеза клеточной стенки микроорганизмов. Все β-лактамные антибиотики (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы и монобактамы) обладают сходным принципом действия. Пенициллины производят бактерицидный эффект, связываясь с пенициллинсвязывающими белками бактерий (выполняют функции ферментов на завершающем этапе синтеза основного компонента клеточной стенки бактерий - пептидогликана). Общность механизма действия β-лактамных антибиотиков заключается в создании препятствий для образования связей между полимерными цепями пептидогликанов с помощью пентаглициновых мостиков (часть структуры антибактериальных препаратов напоминает D-аланил-D-аланин-пептидную цепь клеточной стенки бактерий). Гликопептиды (ванкомицин и тейкопланин*) нарушают синтез клеточной стенки другим способом. Так, ванкомицин оказывает бактерицидное действие, соединяясь со свободной карбоксильной группой пентапептида; таким образом, возникает пространственное препятст-

вие элонгации (удлинения) пептидогликанового хвоста. Изониазид (противотуберкулёзное ЛС) ингибирует синтез миколевых кислот - структурного компонента микобактериальной клеточной стенки.

Механизм бактерицидного действия полимиксинов состоит в нарушении целостности цитоплазматической мембраны бактерий.

Аминогликозиды, тетрациклины, макролиды и левомицетин* угнетают синтез белка бактериальных клеток. Рибосомы бактерий (50S- субъединицы и 30S-субъединицы) и рибосомы человека (6OS-субъеди- ницы и 40S-субъединицы) имеют различную структуру. Этим объясняют избирательное влияние названных групп лекарственных веществ на микроорганизмы. Аминогликозиды и тетрациклины соединяются с 30S-субъединицей рибосомы и ингибируют связывание аминоацилтРНК с А-участком этой тРНК. Кроме того, аминогликозиды нарушают процессы считывания мРНК, блокируя синтез белка. Левомицетин * изменяет процесс транспептидации (перенос растущей аминокислотной цепи на рибосоме с Р-участка на А-участок к вновь приносимым тРНК аминокислотам). Макролиды связываются с 50S-субъединицей рибосомы и ингибируют процесс транслокации (перенос аминокислотной цепи с А-участка на Р-участок).

Хинолоны и фторхинолоны угнетают ДНК-гиразы (топоизомеразу II и топоизомеразу IV) - ферменты, способствующие скручиванию бактериальной ДНК в спираль, необходимую для нормального её функционирования.

Сульфаниламиды ингибируют дигидроптероатсинтетазу, тем самым блокируя синтез предшественников пуринов и пиримидинов (дигидроптеровой и дигидрофолиевой кислот), необходимых для построения ДНК и РНК. Триметоприм угнетает дигидрофолатредуктазу (сродство к бактериальному ферменту очень высоко), нарушая образование тетрагидрофолиевой кислоты (предшественника пуринов и пиримидинов) из дигидрофолиевой. Итак, сульфаниламиды и триметоприм действуют в синергизме, блокируя разные стадии одного процесса - синтеза пуринов и пиримидинов.

5-Нитроимидазолы (метронидазол, тинидазол) оказывают избирательное бактерицидное действие в отношении бактерий, ферментные системы которых способны восстанавливать нитрогруппу. Активные восстановленные формы этих ЛС, нарушая репликацию ДНК и синтез белка, ингибируют тканевое дыхание.

Рифампицин (противотуберкулёзный препарат) специфически угнетает синтез РНК.

Противогрибковые и противовирусные средства обладают некоторым сходством механизмов действия. Производные имидазола и триазола ингибируют синтез эргостерола - главного структурного компо-

нента грибковой клеточной стенки, а полиеновые антибактериальные препараты (амфотерицин, нистатин) связываются с ним. Флуцитозин (противогрибковое ЛС) блокирует синтез грибковой ДНК. Многие противовирусные ЛС (например, ацикловир, идоксуридин, зидовудин - аналоги нуклеозидов) также угнетают синтез вирусных ДНК и

N-холинорецепторы нервно-мышечных синапсов гельминтов - молекулы-мишени таких противогельминтных ЛС, как, пирантел и левамизол. Стимуляция данных рецепторов вызывает тотальный спастический паралич.

Характер, сила и длительность действия ЛС

Длительность, силу и способ взаимодействия ЛС и молекулы-мишени характеризует фармакологический ответ (как правило, обусловлен прямым действием препарата, реже - изменением сопряжённой системы, и только в единичных случаях регистрируют рефлекторный фармакологический ответ).

Основным действием ЛС считают эффект вещества, используемый при лечении данного больного. Другие фармакологические эффекты рассматриваемого ЛС называют второстепенными (или неосновными). Функциональные нарушения, вызванные приёмом препарата, рассматривают как нежелательные реакции (см. главу 4 «Побочные эффекты лекарственных средств»). Один и тот же эффект в одном случае может быть основным, а в другом - второстепенным.

Выделяют генерализованное или локальное (местное) действия ЛС. Местные эффекты наблюдают при использовании мазей, присыпок или ЛС, принимаемых внутрь, не всасывающихся в ЖКТ, либо, наоборот, хорошо всасывающихся, но концентрирующихся в одном органе. В большинстве случаев при проникновении ЛС в биологические жидкости организма его фармакологический эффект может сформироваться в любой точке организма.

Способность многих ЛС воздействовать при монотерапии на различные уровни регуляции и процессы клеточного метаболизма одновременно в нескольких функциональных системах или органах доказывает полиморфизм их фармакологического эффекта. С другой стороны, столь большое многообразие мишеней на всех уровнях регуляции объясняет одинаковый фармакологический эффект ЛС, имеющих различную химическую структуру.

Хаотическое движение молекул позволяет ЛС оказаться вблизи оп- ределённого участка (при высоком аффинитете к рецепторам); при этом необходимого эффекта достигают даже при назначении низких концентраций ЛС. При увеличении концентрации молекул ЛС,

они вступают в реакцию с активными центрами других рецепторов (к которым у них меньший аффинитет); в результате возрастает число фармакологических эффектов, а также исчезает их селективность. Например, β 1 -адреноблокаторы в небольших дозах ингибируют только β 1 -адренорецепторы. Однако при увеличении дозы β 1 -адреноблокаторов, их селективность исчезает, при этом отмечают блокаду всех β-адренорецепторов. Подобную картину наблюдают и при назначении β-адреномиметиков. Таким образом, при увеличении дозы ЛС наряду с некоторым усилением клинического эффекта всегда регистрируют, и значительно, увеличение количества побочных эффектов.

Состояние молекулы-мишени (как в основной, так и в сопряжён- ной системе) необходимо учитывать при прогнозировании и оценке эффективности действия ЛС. Нередко преобладание побочных эффектов над основным действием обусловлено нарушением физиологического баланса вследствие характера заболевания или индивидуальных особенностей пациента.

Более того, сами ЛС могут изменять чувствительность молекул-мишеней, варьируя скорости их синтеза или деградации или индуцируя формирование различных модификаций мишеней под действием внутриклеточных факторов, - всё это приводит к изменению фармакологического ответа.

По фармакологическим эффектам ЛС можно разделить на две группы - вещества, обладающие специфическим и неспецифическим действием. К ЛС неспецифического действия относят препараты, вызывающие развитие широкого спектра фармакологических эффектов путём влияния на различные системы биологического обеспечения. В эту группу ЛС входят, в первую очередь, субстратные вещества: витаминные комплексы, глюкоза и аминокислоты, макроэлементы и микроэлементы, а также растительные адаптогены (например, женьшень и элеутерококк). В связи с отсутствием чётких границ, определяющих основной фармакологический эффект данных ЛС, их назначают большому количеству пациентов при разных заболеваниях.

Если ЛС действует (как агонист или антагонист) на рецепторный аппарат определённых систем, его влияние рассматривают как специфическое. К этой группе ЛС относят антагонисты и агонисты различных подтипов адренорецепторов, холинорецепторов и т.д. Органное расположение рецепторов не влияет на эффект, производимый препаратами специфического действия. Поэтому, несмотря на специфичность действия данных ЛС, регистрируют различные фармакологические ответы. Так, ацетилхолин вызывает сокращение гладких мышц бронхов, пищеварительного тракта, увеличивает секрецию слюнных желёз. Атропин производит противоположный эффект. Избиратель-

ность или селективность действия ЛС отмечают только при изменении активности системы только в определённой её части или в одном органе. Например, пропранолол блокирует все β-адренорецепторы симпатоадреналовой системы. Атенолол - селективный β 1 -адреноблокатор - блокирует только β 1 -адренорецепторы сердца и не влияет на β 2 -адренорецепторы бронхов (при использовании небольших доз). Сальбутамол избирательно стимулирует β 2 -адренорецепторы бронхов, оказывая незначительное действие на β 1 -адренорецепторы сердца.

Избирательность (селективность) действия ЛС - способность вещества накапливаться в ткани (зависит от физико-химических свойств ЛС) и производить требуемый эффект. Избирательность обусловлена также сродством к рассматриваемому морфологическому звену (с учё- том строения клеточной мембраны, особенностей клеточного метаболизма и т.д.). Большие дозы селективно действующих ЛС чаще всего оказывают влияние на всю систему, но вызывают фармакологический ответ, соответствующий специфическому действию ЛС.

Если основная масса рецепторов взаимодействует с ЛС, то отмечают быстрое наступление фармакологического эффекта и его большую выраженность. Процесс происходит только при высоком аффинитете ЛС (его молекула может иметь строение, сходное со структурой естественного агониста). Активность ЛС и длительность его действия в большинстве случаев пропорциональны скорости образования и диссоциации комплекса с рецептором. При повторном введении ЛС иногда регистрируют снижение эффекта (тахифилаксию), т.к. не все рецепторы освободились от предыдущей дозы препарата. Уменьшение выраженности эффекта происходит и в случае истощения рецепторов.

Реакции, регистрируемые при введении лекарственных средств

Ожидаемый фармакологический ответ.

Гиперреактивность - повышенная чувствительность организма к используемому ЛС. Например, при сенсибилизации организма пенициллинами повторное их введение может привести к возникновению реакции гиперчувствительности немедленного типа или даже к развитию анафилактического шока.

Толерантность - снижение чувствительности к применяемому ЛС. Например, при бесконтрольном и длительном приеме β 2 -адреномиметиков, толерантность к ним возрастает, а фармакологический эффект уменьшается.

Идиосинкразия - индивидуальная чрезмерная чувствительность (непереносимость) к данному препарату. Например, причиной идиосинкразии может быть генетически обусловленное отсутс-

твие ферментов, метаболизирующих данное вещество (см. главу 7 «Клиническая фармакогенетика»).

Тахифилаксия - быстро развивающаяся толерантность. К некоторым ЛС, например к нитратам (при непрерывном и длительном их применении), толерантность развивается особенно быстро; при этом препарат заменяют или увеличивают его дозу.

Оценивая время действия ЛС, необходимо выделять латентный период, максимальное действие, время удержания эффекта и время последействия.

Время латентного периода ЛС, особенно при ургентных ситуациях, определяет их выбор. Так, в одних случаях латентный период составляет секунды (сублингвальная форма нитроглицерина), в других - дни и недели (аминохинолин). Длительность латентного периода может быть обусловлена постоянным накоплением ЛС (аминохинолин) в месте его воздействия. Нередко длительность латентного периода зависит от опосредованного механизма действия (гипотензивный эффект β-адреноблокаторов).

Время удержания эффекта - объективный фактор, определяющий кратность назначения и длительность применения ЛС.

Подразделяя ЛС по фармакологическим эффектам, необходимо учитывать, что в основе одного и того же симптома лежат различные механизмы действия. Примером служит гипотензивное влияние таких ЛС, как диуретики, β-адреноблокаторы, блокаторы медленных кальциевых каналов (различные механизмы действия производят один и тот же клинический эффект). Этот факт учитывают при выборе ЛС или их комбинации при проведении индивидуальной фармакотерапии.

Существуют факторы, влияющие на скорость наступления эффекта, его силу и продолжительность при применении лекарственных веществ.

Скорость, способ введения и доза ЛС, взаимодействующего с рецептором. Например, внутривенное струйное введение 40 мг фуросемида производит более быстрый и выраженный диуретический эффект, чем 20 мг препарата, введённого внутривенно или 40 мг диуретика, принятого внутрь.

Тяжёлое течение заболевания и связанные с ним органические поражения органов и систем. Большое влияние на функциональное состояние основных систем оказывают и возрастные аспекты.

Взаимодействие используемых ЛС (см. главу 5 «Взаимодействие лекарственных средств»).

Важно знать, что применение некоторых ЛС оправдано лишь при условии первоначального патологического изменения системы или акцепторов мишени. Так, жаропонижающие ЛС (антипиретики) снижают температуру только при лихорадке.

"Московские аптеки", 2003, N 6

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ. "МИШЕНИ" ДЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

Влияние лекарственных веществ на органы, ткани, клетки обусловлено воздействием на биохимические субстраты, от которых зависит та или иная функция. Современные методы исследования позволяют выяснить, где находится субстрат-мишень, с которым взаимодействует лекарственное вещество, т.е. где локализовано его действие. Благодаря современным техническим средствам и усовершенствованным методическим приемам локализацию действия веществ можно установить не только на системном и органном, но и на клеточном, молекулярном и других уровнях.

Например, препараты наперстянки действуют на

сердечно-сосудистую систему (системный уровень), на сердце

(органный уровень), на мембраны кардиомиоцитов (клеточный

+ +

уровень), на Na , K - АТФазу (молекулярный уровень).

Механизм действия - это способ взаимодействия лекарственного вещества со специфическими участками связывания в организме.

Получение одного и того же фармакологического эффекта возможно с помощью нескольких препаратов, обладающих различными механизмами действия.

"Мишенями" для лекарственных средств служат рецепторы, ионные каналы, ферменты, транспортные системы и гены.

РЕЦЕПТОРЫ

Рецепторы (от лат. recipere - получать) представляют собой биологические макромолекулы, которые предназначены для связывания с эндогенными лигандами (нейротрансмиттерами, гормонами, факторами роста). Рецепторы могут взаимодействовать также с экзогенными биологически активными веществами, в т.ч. и с лекарственными.

При взаимодействии лекарственного вещества с рецептором развивается цепь биохимических превращений, конечным итогом которых является фармакологический эффект. Рецепторы имеют структуру липопротеинов, гликопротеинов, нуклеопротеинов, металлопротеинов. Рецепторную функцию могут выполнять ферменты, транспортные и структурные белки. В каждом рецепторе имеются активные центры, представленные функциональными группами аминокислот, фосфатидов, нуклеотидов и др.

Взаимодействие "вещество - рецептор" осуществляется за счет межмолекулярных связей.

Ковалентные связи - самый прочный вид межмолекулярных связей. Они образуются между двумя атомами за счет общей пары электронов. Ковалентные связи возникают главным образом при действии токсических доз лекарственных веществ или ядов, и разорвать эти связи во многих случаях не удается - наступает необратимое действие. Основываясь на принципе ковалентной связи, П.Эрлих в 1910 г. впервые создал органические препараты мышьяка и предложил их для лечения сифилиса. Эти соединения вступают в прочную ковалентную связь с SН-группами структурных белков и ферментов микроорганизмов, вследствие чего нарушается их функция и происходит гибель микроорганизмов.

Ионные связи возникают между ионами, несущими разноименные заряды (электростатическое взаимодействие). Этот вид связи характерен для ганглиоблокаторов, курареподобных средств и ацетилхолина.

Ион-дипольные и диполь-дипольные связи возникают в электрически нейтральных молекулах лекарственных веществ, чаще всего имеющих неодинаковые атомы. Пара общих электронов бывает сдвинута в сторону какого-либо одного атома и поэтому создает около него электроотрицательность, а у другого атома в силу этого создается электроположительность. Таким образом возникает полярность молекул.

В молекулах лекарственных веществ, попадающих в электрическое поле клеточных мембран или находящихся в окружении ионов, происходит образование индуцированного диполя. Поэтому дипольные связи лекарственных веществ с биомолекулами являются очень распространенными.

Водородные связи по сравнению с ковалентными являются слабыми, но их роль в действии лекарственных веществ весьма существенна. Атом водорода способен связывать атомы кислорода, азота, серы, галогенов. Для возникновения этой связи необходимо присутствие лекарственного вещества вблизи молекулы-мишени на расстоянии не более 0,3 нм, а реагирующий атом в молекуле лекарственного вещества должен находиться на одной прямой с группой ОН или NН2 в молекуле-мишени.

Вандерваальсовы связи возникают между двумя любыми атомами, входящими в лекарственное вещество и молекулы организма, если они будут находиться на расстоянии не более 0,2 нм. При увеличении расстояния связи резко ослабевают.

Гидрофобные связи возникают при взаимодействии неполярных молекул в водной среде.

Лекарственные вещества, как правило, взаимодействуют с молекулами клеток и жидких сред организма с помощью сравнительно слабых связей, поэтому действие их в терапевтических дозах является обратимым.

Выделяют четыре типа рецепторов:

1. Рецепторы, осуществляющие прямой контроль функции эффекторного фермента. Они связаны с плазматической мембраной клеток, фосфорилируют белки клеток и изменяют их активность. По такому принципу устроены рецепторы к инсулину, лимфокинам, эпидермальному и тромбоцитарному факторам роста.

2. Рецепторы, осуществляющие контроль за функцией ионных

каналов. Рецепторы ионных каналов обеспечивают проницаемость

мембран для ионов. Н-холинорецепторы, рецепторы глутаминовой и

аспарагиновой кислот увеличивают проницаемость мембран для ионов

Na , K , Ca , вызывая деполяризацию и возбуждение функции клеток.

ГАМКА-рецепторы, глициновые рецепторы увеличивают проницаемость

мембран для Cl , вызывая гиперполяризацию и торможение функции

клеток.

3. Рецепторы, ассоциированные с G-белками. При возбуждении

этих рецепторов влияние на активность внутриклеточных ферментов

опосредуется через G-белки. Изменяя кинетику ионных каналов и

синтез вторичных мессенджеров (цАМФ, цГМФ, ИФ3, ДАГ, Са),

G-белки регулируют активность протеинкиназ, которые обеспечивают

внутриклеточное фосфорилирование важных регуляторных белков и

развитие разнообразных эффектов. К числу таких рецепторов

относятся рецепторы для полипептидных гормонов и медиаторов

(м-холинорецепторы, адренорецепторы, гистаминовые рецепторы).

Рецепторы 1-3 типов локализованы на цитоплазматической мембране.

4. Рецепторы - регуляторы транскрипции ДНК. Эти рецепторы являются внутриклеточными и представляют собой растворимые цитозольные или ядерные белки. С такими рецепторами взаимодействуют стероидные и тиреоидные гормоны. Функция рецепторов - активация или ингибирование транскрипции генов.

Рецепторы, обеспечивающие проявление действия определенных веществ, называют специфическими.

По отношению к рецепторам лекарственные вещества обладают аффинитетом и внутренней активностью.

Аффинитет (от лат. affinis - родственный) - сродство лекарственного вещества к рецептору, приводящее к образованию комплекса "вещество - рецептор". Внутренняя активность - способность вещества при взаимодействии с рецептором стимулировать его и вызывать тот или иной эффект.

В зависимости от выраженности аффинитета и наличия внутренней активности лекарственные вещества разделяют на две группы.

1. Агонисты (от греч. agonistes - соперник, agon - борьба) или миметики (от греч. mimeomai - подражать) - вещества, обладающие аффинитетом и высокой внутренней активностью. Они взаимодействуют со специфическими рецепторами и вызывают в них изменения, приводящие к развитию определенных эффектов. Стимулирующее действие агониста на рецепторы может приводить к активации или угнетению функции клетки. Полные агонисты, взаимодействуя с рецепторами, вызывают максимально возможный эффект. Частичные агонисты при взаимодействии с рецепторами вызывают меньший эффект.

2. Антагонисты (от греч. antagonisma - соперничество, anti - против, agon - борьба) или блокаторы - вещества с высоким аффинитетом, но лишенные внутренней активности. Они связываются с рецепторами и препятствуют действию эндогенных агонистов (медиаторов, гормонов).

Если антагонисты занимают те же рецепторы, что и агонисты, то их называют конкурентными антагонистами.

Если антагонисты занимают другие участки макромолекулы, не относящиеся к специфическому рецептору, но взаимосвязанные с ним, то их называют неконкурентные антагонисты.

Некоторые лекарственные вещества сочетают в себе способность возбуждать один подтип рецепторов и блокировать другой. Их называют агонисты-антагонисты. Так, наркотический анальгетик пентазоцин является антагонистом m- и агонистом d- и k-опиоидных рецепторов.

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

Участками связывания лекарственных веществ могут являться ионные каналы. Эти каналы представляют основные пути, по которым ионы проникают через клеточные мембраны.

Естественными лигандами ионных каналов являются медиаторы:

ацетилхолин, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), возбуждающие

аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая, глицин). Увеличение

трансмембранной проводимости определенных ионов через

соответствующие каналы приводит к изменению электрического

потенциала мембраны. Так, ацетилхолин способствует открытию

ионного канала N-холинорецептора, в результате чего Na проходит в

клетку, вызывая деполяризацию мембраны и развитие потенциала

действия. ГАМК способствует открытию ионного канала Cl , что

вызывает гиперполяризацию мембраны и развитие синаптического

торможения.

Важную роль в действии лекарственных веществ играет их способность имитировать или блокировать действие эндогенных лигандов, регулирующих ток ионов через каналы плазматической мембраны.

В середине ХХ в. было установлено, что местные анестетики

блокируют потенциалозависимые Na -каналы. К числу блокаторов

Na -каналов относятся и многие противоаритмические средства. Кроме

того, было показано, что ряд противоэпилептических средств

(дифенин, карбамазепин) также блокируют потенциалозависимые

Na -каналы и с этим связана их противосудорожная активность. Ионы

Са принимают участие во многих физиологических процессах: в

сокращении гладких мышц, в проведении возбуждения по проводящей

системе сердца, в секреторной активности клеток, в функции

тромбоцитов и др. Вхождение ионов Са внутрь клетки через

потенциалозависимые Са -каналы нарушает группа лекарственных

препаратов, получившая название "блокаторы Са -каналов".

Препараты этой группы широко применяются для лечения

ишемической болезни сердца, сердечных аритмий, гипертонической

болезни. Са -каналы гетерогенны, и поэтому интерес представляет

поиск их блокаторов с преимущественным действием на сердце и

сосуды (особенно разных областей: периферических, мозга, сердца и

др.). Так, верапамил оказывает более сильное влияние на ино-,

хронотропную функцию сердца и на атриовентрикулярную проводимость

и в меньшей степени на гладкие мышцы сосудов; нифедипин оказывает

большее воздействие на гладкие мышцы сосудов и меньшее - на

функцию сердца; дилтиазем в равной степени влияет на гладкие мышцы

сосудов и проводящую систему; нимодипин обладает избирательным

цереброваскулярным действием.

В последние годы большое внимание привлекают вещества,

регулирующие функцию К -каналов. Среди лекарственных веществ

имеются как активаторы, так и блокаторы К -каналов.

Активаторы К -каналов участвуют в механизме их открытия и

выхода ионов К из клетки. Если этот процесс происходит в гладких

мышцах сосудов, то развивается гиперполяризация мембраны, тонус

мышц уменьшается и снижается артериальное давление. Такой механизм

гипотензивного действия характерен для миноксидила.

+ +

Блокаторы К -каналов препятствуют их открытию и поступлению К

в клетки. Антиаритмический эффект амиодарона и соталола обусловлен

блокадой К -каналов клеточных мембран миокарда.

Блокада АТФ-зависимых К -каналов в поджелудочной железе приводит к

повышению секреции инсулина. По такому принципу действуют

противодиабетические средства группы сульфонилмочевины

(хлорпропамид, бутамид и др.).

ФЕРМЕНТЫ

Важной "мишенью" для действия лекарственных веществ являются ферменты. В медицине широко применяются группы лекарственных средств, снижающие активность определенных ферментов. Блокада фермента моноаминоксидазы приводит к снижению метаболизма катехоламинов и повышению их содержания в ЦНС. На этом принципе основано действие антидепрессантов - ингибиторов МАО (ниаламида, пиразидола). Механизм действия нестероидных противовоспалительных средств обусловлен ингибированием фермента циклооксигеназы и снижением биосинтеза простагландинов.

В качестве гипотензивных средств используются ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (каптоприл, эналаприл, периндоприл и др.). Антихолинэстеразные средства, блокирующие фермент ацетилхолинэстеразу и стабилизирующие ацетилхолин, применяются для повышения тонуса гладкомышечных органов (ЖКТ, мочевого пузыря) и скелетных мышц.

ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ

Лекарственные средства могут воздействовать на транспортные

системы молекул, ионов, медиаторов. Транспортную функцию выполняют

так называемые транспортные белки, переносящие вышеуказанные

молекулы и ионы через клеточную мембрану. Эти белки имеют

"распознающие участки" - места связывания эндогенных веществ, с

которыми могут взаимодействовать лекарственные средства. Блокада

+ +

Н, К -АТФазы секреторной мембраны париетальных клеток

("протонного насоса") прекращает поступление ионов водорода в

полость желудка, что сопровождается угнетением образования HCl.

Такой механизм действия характерен для омепразола, пантопразола,

которые применяются для лечения язвенной болезни желудка и

двенадцатиперстной кишки.

ГЕНЫ

Перспективной "мишенью" для действия лекарственных средств являются гены. С помощью избирательно действующих лекарственных средств возможно оказывать прямое влияние на функцию определенных генов. Учитывая полиморфизм генов, такая задача достаточно сложна. Тем не менее исследования в области генной фармакологии получают все более широкое развитие.

Для эффективного функционирования многоклеточного организма необходимо точное координированное взаимодействие между различными биологическими молекулами, надмолекулярными и субклеточными структурами, клетками и органами, которые представляют собой функционально единую целостную систему. Физиологические функции органа, системы органов и организма в целом невыполнимы обособленными специализированными клетками и, тем более, субклеточными образованиями. Одним из ключевых этапов эволюции живого явилось приобретение способности макромолекул к обратимому, специфическому межмолекулярному взаимодействию, приводящему к изменению их функциональной активности, что в итоге предопределило регулируемость физиологических процессов на различных уровнях организации биологической системы - молекулярном, надмолекулярном, субклеточном, клеточном, органном и, наконец, в организме в целом. Биохимические процессы внутри клеток многоклеточного организма согласованы и, одновременно, адекватны возможностям отдельной клетки, ее способности участвовать в работе целостного организма. Подобный характер клеточного поведения в многоклеточном организме обусловлен способностью клеток вступать в регулируемые как со стороны клетки, так и со стороны организма, межклеточные, матрикс-клеточные и гуморально-клеточные взаимодействия посредством специализированных структур пептидной природы - рецепторов. Посредством межклеточных, матрикс-клеточных и гуморально-клеточных взаимодействий из клеток различной физиологической специализации, в которых осуществляется согласованная регуляция метаболической активности, позволяющая им выполнять физиологические функции, присущие органу/системе органов формируется функционально единая структура ткани, органа, организма в целом.

Структуры цитоплазматической мембраны многоклеточного организма в ходе эволюции формировались на основе уже существующих внутриклеточных структур пептидной природы 1 . Модификация соответствующих генов и эволюционный отбор обеспечили как сохранение определенных доменов белковой молекулы, получивших название эволюционно-консервативных, так и способствовали появлению новых, призванных выполнять специализированные функции. Наличие эволюционно-консервативных доменов в молекулах пептидной природы различного функционального назначения значимо, в числе прочего, для регуляции их функциональной активности по единым принципам, едиными воздействиями.

Домены молекул пептидной природы , обогащенных остатками серы в составе цистеина, принадлежат к эволюционно-консервативным компонентам молекулярной структуры. Обогащенные цистеином эволюционно-консервативные домены обнаружены в составе внеклеточных и внутриклеточных транспортных, регулирующих, сенсорных, исполнительных, структурных и других, по функциональному назначению, молекул пептидной природы

Рецепторные тирозинкиназы имеют эволюционно консервативный внеклеточный домен, обогащенный остатками цистеина. Сульфгидрильные группы остатков цистеина в составе поверхностно-клеточных доменов рецепторов чувствительны к действию окисляющих реагентов, приводящих к образованию внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных сшивок (связей) , изменяющих функциональный статус поверхностно-клеточного домена (например, повышение тропности и/или специфичности в отношении агониста или агонистов) и/или инициирующих активность рецепторной тирозинкиназы 2 .

Остатки серы в составе цистеина эволюционно-консервативных доменов молекул пептидной природы являются одними из важнейших точек приложения факторов, влияющих на конформацию молекул пептидной природы 3 4 .

Возможность обратимого, регулируемого изменения конформации внеклеточных и внутриклеточных молекул пептидной природы (включая рецепторы, мембранные транспортеры, ионные каналы, ферменты и другие специализированные молекулы пептидной природы ), сопряженная с их способностью к выполнению физиологических функций, сделала конформационные перестройки на уровне третичной и четвертичной структур одним из эффективных универсальных механизмов воздействия на активность различных белков, включая молекулы, ответственные за межклеточные, матрикс-клеточные, гуморально-клеточные взаимодействия, обмен ионами и субстратами, организацию структуры клетки и ее метаболическую активность 5 6 7

Регуляторное воздействие на остатки серы в составе цистеина эволюционно-консервативных доменов структурных и функциональных молекул пептидной природы внеклеточного и внутриклеточного пространств определяется, в числе прочего, окислительно-восстановительным (редокс) окружением. Редокс-окружение отражает уровень соотношения взаимопревращаемых окисленной и восстановленной специфической редокс-пары. Редокс-окружение, образуемое взаимосвязанными редокс-парами в биологических жидкостях внеклеточного пространства, цитозоля и органелл клеток определяется суммированием в них восстановительного потенциала и восстановительной емкостью этих редокс пар.

Восстанавливающие эквиваленты преобладают как во внутриклеточном пространстве, так и вне клетки, но величина их отношения к окисляющим формам вне клетки и в ряде органелл несколько ниже внутриклеточного значения в цитозоле. Вследствие этого окружающая клетки среда и среда ряда внутриклеточных органелл характеризуется большей окисляющей способностью в сравнении с цитозолем 8 9 10

Функционально-активные конформации молекул внутриклеточного и внеклеточного пространства адаптированы к эволюционно сложившимся особенностям окислительно-восстановительных условий. Как отмечалось выше, остатки серы в составе цистеина структурных и регуляторных молекул пептидной природы являются одними из важнейших точек приложения эффекторных молекул, осуществляющих редокс-модуляцию. Цистеин сосредоточен в эволюционно-консервативных доменах структурных и функциональных молекул пептидной природы. Остатки цистеина эволюционно консервативных доменов регуляторных, структурных, каталитических молекул пептидной природы , редокс-модуляция связи серы которых приводит к изменению конформации и/или функциональной активности, получили обозначение «горячих цистеинов». Сульфгидрильные группы цистеина принимают участие в большинстве реакций в виде меркаптидного иона RS?. Меркаптидные ионы белков более реакционоспособны и легче подвержены окислению, чем недиссоциированные сульфгидрильные группы. Значение рК а (константы ионизации) у SH-групп белков варьирует в широких пределах и в значительной степени определяется их взаимодействием с соседними функциональными группами в молекуле. Наличие положительно заряженной группы в непосредственной близости от SH-группы понижает ее константу ионизации. Значение рК а большинства SH-групп в активных центрах ферментов составляет приблизительно 8,5 11 12 . Следовательно, при физиологическом значении рН в клеточном микроокружении и клетке (~7,4) существующие сульфгидрильные группы большинства молекул пептидной природы остаются неионизированными из-за высокого значения рК а, поэтому они устойчивы к окислению. «Горячие цистеины» эволюционно консервативных доменов окружены близлежащими положительно заряженными группами, вследствие чего их рК а колеблется от 4,7 до 5,4. Таким образом, сульфгидрильная группа в их составе ионизирована даже при физиологическом значении рН и легко подвергается окислительной модификации. Функционально активная конформация основной массы внутриклеточных молекул пептидной природы формируется при восстановлении остатков серы в составе «горячих цистеинов» до сульфгидрильных групп 13 14 15 16 . Напротив, функционально активная конформация основной массы внеклеточных молекул пептидной природы формируется при образовании дисульфидной связи между остатками серы «горячих цистеинов» 17 18 19 20 .

Восстановленный (GSH) и окисленный глутатион (GSSG) представляют одну из основных биохимических пар биологических пространств, значение соотношения которых (GSH/GSSG) определяет величину окислительно-восстановительного потенциала соответствующего физиологического пространства 21 22 . Физиологически необходимое значение соотношения GSH/GSSG регулируется и формируется соответствующими биохимическими системами, отслеживается молекулярными редокс-сенсорами в структуре поверхностно-клеточных рецепторов, ионных каналов, биорегуляторов, ферментов, транспортеров цитоплазматической мембраны и других молекул пептидной природы внутриклеточного и внеклеточного пространств 23 24 . Следствием реакции молекулярного редокс-сенсора на изменение величины редокс-потенциала является формирование регуляторного сигнала, влияющего на биохимические процессы или процесс, клеточную реакцию или реакции 25 26 , определяющие, с одной стороны, клеточный ответ, с другой - восстановление физиологически адекватной величины редокс-потенциала. В этой связи, факторы, влияющие на величину соотношения между восстановленным и окисленным глутатионом (активные формы кислорода 27 , активные формы азота 28 29 30 , монооксид углерода 31 , органические перекиси 32 ), способны модулировать биохимические процессы и клеточные реакции посредством изменения величины редокс потенциала и величины соотношения в системе восстановленный/окисленный глутатион.

Рисунки 2 и 3 на примере биорегуляторов и их рецепторов иллюстрируют принцип молекулярного механизма участия сульфгидрильных групп эволюционно консервативных цистеин-содержащих доменов, восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона в контроле функциональной активности молекул пептидной природы внеклеточного пространства.

Рис.2. Воздействие с участием восстановленного глутатиона (GSH) на дисульфидные сшивки (связи) в структуре функционально активных внеклеточных и/или их поверхностно-клеточных рецепторов приводит к формированию пула молекул, конформация которых ограничивает их физиологически адекватные взаимодействия.

Рис.3. Воздействие на сульфгидрильные (SH) группы в структуре функционально неактивных внеклеточных биорегуляторов пептидной природы и/или их поверхностно-клеточных рецепторов, обусловленное снижением величины редокс-потенциала вследствие увеличения количества окисленного глутатиона (GSSG), приводит к формированию пула молекул, конформация которых адекватна характеру ситуационно обусловленных физиологических взаимодействий.

Необходимо отметить, что активные формы кислорода, активные формы азота, органические перекиси способны непосредственно осуществлять окислительную модификацию сульфгидрильных групп до сульфенатов. Однако, физиологический характер такого воздействия будет реализован, если после образования сульфената с участием GSH образуется смешанный дисульфид с глутатионом (реакция глутатионилирования) и далее будет осуществлен упорядоченный ферментативный процесс формирования правильной дисульфидной сшивки или восстановления остатка серы в составе цистеина 33 . В противном случае может произойти необратимое окисление остатка серы в составе цистеина до цистин-сульфоновой кислоты (Cys-SO 3 H) и, как следствие, утрата возможности регулировать функцию белка.

Рисунок 1. Типы молекулярных мишеней для действия лекарственных средств .

Молекулярная мишень -- это молекула или молекулярный ансамбль, имеющий специфический центр связывания для биологически активного соединения. Молекулярная мишень может быть представлена мембранными белками, распознающими гормоны или нейротрансмиттеры (рецепторы), а также ионными каналами, нуклеиновыми кислотами, молекулами-переносчиками или ферментами. Как видно из Рисунка 2, не все лекарственные соединения воздействуют на рецепторы. Большинство лекарственных средств должны связаться с молекулярной мишенью, чтобы произвести эффект, но существуют и исключения. Уже в первых исследованиях эффектов лекарств на тканях животных в конце XIX в. стало ясно, что большинство ФАВ реализуют специфическое действие в определенных тканях, т.е. соединение, которое оказывает эффект на один тип ткани, может не влиять на другой; одно и то же вещество может оказывать совершенно разные эффекты на разные ткани. Например, алкалоид пилокарпин, как и нейротрансмиттер ацетилхолин, вызывает сокращение гладких мышц кишечника и тормозит частоту сердечных сокращений. С учетом этих феноменов Сэмуэль Лэнгли (1852-1925) в 1878 г., основываясь на изучении эффектов алкалоидов пилокарпина и атропина на слюноотделение, предположил, что «существуют некие рецепторные вещества... с которыми оба могут образовывать соединения». Позже, в 1905 г., изучая действие никотина и кураре на скелетные мышцы, он обнаружил, что никотин вызывает сокращения, когда действует на определенные небольшие участки мышц. Лэнгли заключил, что «рецепторная субстанция» для никотина находится в этих участках и что кураре действует путем блокады взаимодействия никотина с рецептором .

Рисунок 2. Эффективность по отношению к эндогенному агонисту.

Таким образом, очевидно, что действие некоторых соединение может быть обусловлено не столько развитием биологического ответа на связывание с молекулярной мишенью, сколько препятствием связыванию эндогенного лиганда. Действительно, если рассматривать взаимодействие лиганда и рецептора, можно отметить, что существующие в настоящее время лекарственные соединения могут играть роль как агониста, так и антагониста. На Рисунке 3 можно увидеть более подробную классификацию лигандов по отношению к эффектам, ими обусловленными. Агонисты различаются по силе и направлению физиологического ответа, вызываемого ими. Данная классификация не связана с аффинностью лигандов и опирается лишь на величину отклика рецептора. Таким образом, можно выделить следующие классы агонистов:

o Суперагонист -- соединение, способное вызывать более сильный физиологический ответ, чем эндогенный агонист.

o Полный агонист -- соединение, вызывающее такой же отклик, как эндогенный агонист (например, изопреналин, агонист в-адренорецепторов).

o В случае меньшего отклика соединение называют частичным агонистом (например, арипипразол -- частичный агонист дофаминовых и серотониновых рецепторов).

o В случае если у рецептора имеется базальная (конститутивная) активность, некоторые вещества -- обратные агонисты -- могут уменьшать её. В частности, обратные агонисты рецепторов ГАМК A обладают анксиогенным или спазмогеннымдействием, однако могут усиливать когнитивные способности .

Рассматривая механизм связывания лиганда и рецепторной молекулы, можно увидеть, что специфичность и сила связывания обусловлена особенностями строения обоих компонентов. В частности, важную роль играет активный центр белков - определённый участок белковой молекулы, как правило, находящийся в её углублении ("кармане"), сформированный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способный комплементарно связываться с лигандом. В линейной последовательности полипептидной цепи радикалы, формирующие активный центр, могут находиться на значительном расстоянии друг от друга.

Высокая специфичность связывания белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра белка структуре лиганда. Под комплементарностью понимают пространственное и химическое соответствие взаимодействующих молекул. Лиганд должен обладать способностью входить и пространственно совпадать с конформацией активного центра. Это совпадение может быть неполным, но благодаря конформационной лабильности белка активный центр способен к небольшим изменениям и "подгоняется" под лиганд. Кроме того, между функциональными группами лиганда и радикалами аминокислот, образующих активный центр, должны возникать связи, удерживающие лиганд в активном центре. Связи между лигандом и активным центром белка могут быть как нековалентными (ионными, водородными, гидрофобными), так и ковалентными. Активный центр белка - относительно изолированный от окружающей белок среды участок, сформированный аминокислотными остатками. В этом участке каждый остаток благодаря своему индивидуальному размеру и функциональным группам формирует "рельеф" активного центра.

Объединение таких аминокислот в единый функциональный комплекс изменяет реакционную способность их радикалов, подобно тому, как меняется звучание музыкального инструмента в ансамбле. Поэтому аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, часто называют "ансамблем" аминокислот.

Уникальные свойства активного центра зависят не только от химических свойств формирующих его аминокислот, но и от их точной взаимной ориентации в пространстве. Поэтому даже незначительные нарушения общей конформации белка в результате точечных изменений его первичной структуры или условий окружающей среды могут привести к изменению химических и функциональных свойств радикалов, формирующих активный центр, нарушать связывание белка с лигандом и его функцию. При денатурации активный центр белков разрушается, и происходит утрата их биологической активности.

Часто активный центр формируется таким образом, что доступ воды к функциональным группам его радикалов ограничен, т.е. создаются условия для связывания лиганда с радикалами аминокислот.

В некоторых случаях лиганд присоединяется только к одному из атомов, обладающему определённой реакционной способностью, например присоединение О 2 к железу миоглобина или гемоглобина. Однако свойства данного атома избирательно взаимодействовать с О 2 определяются свойствами радикалов, окружающих атом железа в составе тема. Гем содержится и в других белках, таких как цитохромы. Однако функция атома железа в цитохромах иная, он служит посредником для передачи электронов от одного вещества другому, при этом железо становится то двух-, то трёхвалентным.

Центр связывания белка с лигандом часто располагается между доменами. Например, протеолитический фермент трипсин, участвующий в гидролизе пептидных связей пищевых белков в кишечнике, имеет 2 домена, разделённых бороздкой. Внутренняя поверхность бороздки формируется аминокислотными радикалами этих доменов, стоящими в полипептидной цепи далеко друг от друга (Сер 177 , Гис 40 , Асп 85).

Разные домены в белке могут перемещаться друг относительно друга при взаимодействии с лигандом, что облегчает дальнейшее функционирование белка. В качестве примера можно рассмотреть работу гексокиназы, фермента, катализирующего перенос фосфорного остатка с АТФ на молекулу глюкозы (при её фосфорилировании). Активный центр гексокиназы располагается в расщелине между двумя доменами. При связывании гексокиназы с глюкозой окружающие её домены сближаются, и субстрат оказывается в "ловушке", что облегчает его дальнейшее фосфорилирование.

Основное свойство белков, лежащее в основе их функций, - избирательность присоединения к определённым участкам белковой молекулы специфических лигандов.

Классификация лигандов

· Лигандами могут быть неорганические (часто ионы металлов) и органические вещества, низкомолекулярные и высокомолекулярные вещества;

· существуют лиганды, которые изменяют свою химическую структуру при присоединении к активному центру белка (изменения субстрата в активном центре фермента);

· существуют лиганды, присоединяющиеся к белку только в момент функционирования (например, О 2 , транспортируемый гемоглобином), и лиганды, постоянно связанные с белком, выполняющие вспомогательную роль при функционировании белков (например, железо, входящее в состав гемоглобина).

В тех случаях, когда аминокислотные остатки, формирующие активный центр, не могут обеспечить функционирование данного белка, к определённым участкам активного центра могут присоединяться небелковые молекулы. Так, в активном центре многих ферментов присутствует ион металла (кофактор) или органическая небелковая молекула (кофермент). Небелковую часть, прочно связанную с активным центром белка и необходимую для его функционирования, называют"простатическая группа". Миоглобин, гемоглобин и цитохромы имеют в активном центре простетическую группу - гем, содержащий железо.

Соединение протомеров в олигомерном белке - пример взаимодействия высокомолекулярных лигандов. Каждый протомер, соединённый с другими протомерами, служит для них лигандом, так же как они для него.

Иногда присоединение какого-либо лиганда изменяет конформацию белка, в результате чего формируется центр связывания с другими лигандами. Например, белок кальмодулин после связывания с четырьмя ионами Са 2+ в специфических участках приобретает способность взаимодействовать с некоторыми ферментами, меняя их активность .

Важным понятием в теории взаимодействия лиганда и активного центра биологической мишени является «комплементарность». Активный центр фермента должен определенным образом соответствовать лиганду, что отражается в некоторых требованиях, предъявляемых к субстрату.

Рисунок 3. Схема взаимодействия лиганда и молекулярной мишени.

Так, например, ожидаемо, что для успешного взаимодействия необходимо соответствие размеров активного центра и лиганда (см. 2 положение на рисунке 3), что позволяет повысить специфичность взаимодействия и оградить активный центр от заведомо неподходящих субстратов. Вместе с тем, при возникновении комплекса «активный центр-лиганд» возможны следующие виды взаимодействий:

· вандерваальсовы связи (положение 1, рисунок 3), обусловленые флуктуациями электронных облаков вокруг противоположно поляризованных соседних атомов;

· электростатические взаимодействия (положение 3, рисунок 3), возникающие между противоположно заряженными группами;

· гидрофобные взаимодействия (положение 4, рисунок 3), обусловленные взаимным притяжением неполярных поверхностей;

· водородные связи (положение 5, рисунок 3), возникающие между подвижным атомом водорода и электроотрицательными атомами фтора, азота или кислорода.

Несмотря на относительно малую силу описанных взаимодействий (в сравнении с ковалентными связями), не стоит недооценивать их важность, отражающуюся в повышении аффинности связывания.

Обобщая вышесказанное, можно отметить, что процесс связывания лиганда и молекулярной мишени представляет собой высокоспецифический процесс, контролируемый как размером лиганда, так и его строением, что позволяет обеспечить селективность взаимодействия. Тем не менее, возможно взаимодействие между белком и не свойственным ему субстратом (т.н. конкурентное ингибирование), которое выражается в связывании с активного центра со схожим, но не целевым лигандом. Стоит отметить, что конкурентное ингибирование возможно как в естественных условиях (ингибирование малонатом фермента сукцинатдегидрогеназы, ингибирование фумаратгидратазы пиромеллитовой кислотой ), так и искусственно, во время приема лекарственных средств (ингибирование моноаминооксидазы ипрониазидом, ниаламидом, ингибирование дигидроптероатсинтетазы сульфаниламидами - структурными аналогами пара-аминобензойной кислоты, ингибирование ангиотензинпревращающего фермента каптоприлом, эналаприлом).

Таким образом, существует возможность целенаправленного изменения активности многих молекулярных систем при помощи синтетических соединений, имеющих строение, схожее с естественными субстратами.

Тем не менее, поверхностное понимание механизмов взаимодействия лигандов и молекулярных мишеней может быть чрезвычайно опасно и, зачастую, приводить к трагическим последствиям. Наиболее известным случаем можно считать т.н. «талидомидовую трагедию», которая привела вследствие приема беременными женщинами недостаточно изученного лекарственного соединения талидомида к рождение тысяч детей с врожденными уродствами.