Анализ рпга 1. Анализ крови рпга и его расшифровка

Сифилис РПГА (реакция пассивной гемагглютинации), титр

Выявление в сыворотке крови специфических антител к бледной трепонеме (Treponema pallidum), используемое для подтверждения результатов неспецифических тестов на сифилис, скрининга сифилиса, обследования контактных лиц и доноров крови.

Синонимы русские

Люэс, бледная трепонема.

Синонимы английские

Syphilis, passive hemagglutination test; Syphilis, indirect hemagglutination test; Treponema Pallidum Hemaglutination Assay, TPHA.

Метод исследования

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Сифилис – инфекция, передающаяся половым путем, возбудителем которой является спирохета Treponema pallidum subspecies pallidum. Попадание этой бактерии в организм приводит к развитию иммунного ответа, сопровождающегося выработкой как неспецифических ("нетрепонемных"), так и специфических ("трепонемных") антител. Выявление антител к T. pallidumсоставляет основу лабораторного подтверждения сифилиса. В зависимости от типа антител, определяемых в реакции, серологические исследования разделяют на неспецифические ("нетрепонемные") и специфические ("трепонемные"). Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) относится к "трепонемным", то есть специфическим в отношении T. pallidum тестам.

РПГА основана на феномене агглютинации , на поверхности которых адсорбированы антигены T. pallidum (реагент РПГА), при добавлении к ним сыворотки больного сифилисом, содержащей специфические антитела к спирохете. Такие антитела появляются в крови пациентов с сифилисом через 2 (IgM) и 4 (IgG) недели после инфицирования. Следует отметить, что этот период может удлиняться до 6 недель. Поэтому чувствительность РПГА в первичном периоде сифилиса несколько уступает чувствительности этого метода во вторичном и третичном периодах и составляет около 86 %. Преимуществом РПГА является высокая специфичность (96-100 %), позволяющая использовать этот анализ в качестве подтверждающего теста после положительного результата какого-либо неспецифического, "нетрепонемного" исследования (например, ). Чувствительность РПГА во вторичном, третичном периоде сифилиса, а также при скрытом сифилисе составляет 99-100 %.

Чувствительность РПГА и других "трепонемных" тестов превосходит чувствительность неспецифических ("нетрепонемных") тестов, таких как микрореакция преципитации (МРП) с кардиолипиновым антигеном. Поэтому в последнее время в качестве скринингового теста на сифилис стали чаще применять "трепонемные" тесты, в том числе РПГА. При положительном результате скринингового исследования на сифилис с помощью РПГА следует провести подтверждающий тест. В этом случае им является любой другой "трепонемный" тест, но не РПГА (например, иммуноферментный анализ).

Как правило, результат РПГА остается положительным даже после лечения сифилиса. Исключение составляет ситуация, когда терапия была проведена в самом начале заболевания. Так как результат сохраняется положительным пожизненно, РПГА не предназначена для дифференциальной диагностики раннего и позднего сифилиса. По этой же причине данное исследование не используют, чтобы оценивать эффективность лечения заболевания.

При добавлении сыворотки больных сифилисом к реагенту РПГА происходит агглютинация (склеивание) и выпадение в осадок эритроцитов. Степень агглютинации зависит от концентрации антител в сыворотке, поэтому РПГА позволяет не только выявить присутствие антител, но и определить их количество. Результат анализа представлен в виде титра антител. Любой положительный титр указывает на возможную инфекцию T. pallidum, однако возможны ложноположительные реакции. Значительно повышенные показатели характерны для вторичного и скрытого раннего сифилиса.

Ложноположительные результаты РПГА наблюдаются в 0,05-2,5 % случаев и чаще всего обусловлены наличием в сыворотке пациента аутоантител (при системных заболеваниях соединительной ткани, например при системной красной волчанке), антител к другим возбудителям, схожим по антигенной структуре с T. pallidum ( , сапрофитные трепонемы полости рта и гениталий), а также другими физиологическими и патологическими состояниями ( , онкологические заболевания, ). Как правило, титр ложноположительной реакции РПГА низкий. Исключение составляют результаты РПГА у пациентов с диффузными заболеваниями соединительной ткани и злокачественными новообразованиями, когда титр антител может достигать очень высоких значений. Ложноположительные реакции негативируются спонтанно и бесследно в течение 4-6 месяцев (острая ложноположительныя реакция, часто на фоне беременности) или более длительного периода (хроническая ложноположительная реакция).

Учитывая эти особенности, результат РПГА следует интерпретировать с учетом дополнительных анамнестических и лабораторных данных. При подтверждении диагноза "сифилис" необходимо исключить наличие других инфекций, передающихся половым путем, а также обследовать всех половых партнеров и членов семьи пациента.

Для чего используется исследование?

• Чтобы подтвердить диагноз "сифилис" при положительном результате неспецифического скринингового теста;
• для скрининга сифилиса;
• для обследования лиц, находившихся в половом и тесном бытовом контакте с больным сифилисом;
• для исключения сифилиса у донора крови.

Когда назначается исследование?

При обследовании:

• пациента с клиническими признаками сифилиса (безболезненный эрозивный или язвенный дефект на твердом основании) и регионарной лимфаденопатии (первичный сифилис), полиморфная кожная сыпь, многоочаговая или диффузная алопеция, сифилитическая лейкодерма (вторичный сифилис), плотноэластический узел с распадом или формированием "сухого" рубца (третичный сифилис);
• лиц, находившихся в половом и тесном бытовом контакте с больным сифилисом;
• донора крови;
• при ежегодном профилактическом обследовании, госпитализации в стационар, оформлении санитарной книжки.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

• первичный, вторичный, третичный, а также скрытый сифилис (приобретенный и врождённый);
• беременность;
• гепатиты В и С;
• употребление инъекционных наркотиков;
• острый инфаркт миокарда;
• диффузные заболевания соединительной ткани;
• возвратный тиф;
• клещевой боррелиоз;
• тропические трепонематозы (фрамбезия, беджель, пинта);
• воспалительные процессы, обусловленные сапрофитными трепонемами полости рта и гениталий;
• злокачественные новообразования;
• обширная травма и переломы;
• бактериальный эндокардит;
• туберкулез;
• инфекционный мононуклеоз;
• поствакцинальная реакция.

Причины отрицательного результата:

• отсутствие сифилиса;
• первые 2-4 недели после инфекции T. pallidum.

Что может влиять на результат?

Кто назначает исследование?

Дерматовенеролог, невролог, врач общей практики, эпидемиолог.

Литература

• French P, Gomberg M, Janier M, Schmidt B, van Voorst Vader P, Young H; IUST. IUSTI: 2008 European Guidelines on the Management of Syphilis. Int J STD AIDS. 2009 May;20(5):300-9.
• Seña AC, White BL, Sparling PF. Novel Treponema pallidum serologic tests: a paradigm shift in syphilis screening for the 21stcentury. Clin Infect Dis. 2010 Sep 15;51(6):700-8.
• Luger A. Diagnosis of syphilis. Bull World Health Organ. 1981;59(5):647-54.
• Holmes K.K. Sexually Transmitted Diseases / K.K. Holmes, P.F. Sparling, W.E. Stamm; 4th ed. - McGraw-Hill, 2008.

Анализ крови РПГА - одно из важнейших исследований, которое помогает определить наличие патогенных возбудителей в организме.

Метод РПГА очень часто используется при подозрении на сифилис, инфицирование кишечного тракта, коклюш и другие опасные патологии. Когда выписывается направление на подобное исследование, пациенты интересуются, как сдают биоматериал и насколько достоверные результаты дает методика. Об этом и пойдет речь далее.

Что такое РПГА и какие имеет особенности

Далеко не каждый человек знает, что это такое и как расшифровывается аббревиатура РПГА. Под этим сокращением подразумевается реакция пассивной гемагглютинации, методика нужна для определения патогенного процесса в организме.

Этот тест выявляет антигены бледной трепонемы (люис) - патогенного микроорганизма, провоцирующего возникновение сифилиса. Если обследуемый здоров и не страдает от каких-либо хронических заболеваний, при попадании в организм бледной трепонемы иммунитет начинает активно вырабатывать антитела.

Наличие в исследуемом биоматериале антител бледной трепонемы - основание для диагностирования сифилиса.

Условно тестирование на сифилис можно разделить на 2 вида:

• специфическое;
• неспецифическое.

Классификация анализа на категории зависит от вида антител, обнаруженных в полученном образце крови. Несмотря на то что впервые такой метод диагностики был проведен в 1965 году, тестирование оказалось настолько эффективным и результативным, что сегодня оно до сих пор не теряет актуальности.

Несомненным достоинством диагностики является то, что она позволяет обнаружить инфекцию на любом этапе развития, в том числе в латентной стадии.

Показания к проведению

Врачи советуют сдать анализ РПГА в следующих случаях:

• у пациента проявляются клинические симптомы сифилиса (появление эрозий, язв, увеличение лимфоузлов) и регионарной лимфаденопатии; в этом случае РПГА на сифилис является незаменимым тестом, поскольку позволяет выявить болезнь на первичной, вторичной и третичной стадии;
• возникновение признаков очаговой или диффузной алопеции;
• если человек имел половой контакт с носителем сифилиса;
• человек хочет стать донором, сдавать кровь и плазму;
• РПГА входит в ежегодное профилактическое обследование, которое назначается работникам разных госучреждений;
• при оформлении медицинской книжки;
• при госпитализации.

Какие заболевания можно выявить в ходе диагностики

Чаще всего положительный результат теста свидетельствует о наличии сифилиса (в 70% случаев) — как врожденного, так и приобретенного, а также может говорить о таких патологиях:

• ВИЧ-инфекция;
• разные формы гепатита;
• недавно перенесенный инфаркт миокарда;
• возвратный тиф;
• туберкулез;
• наличие венерических заболеваний;
• клещевой боррелиоз;
• дифтерия;
• диффузные заболевания соединительной ткани;
• злоупотребление наркотическими веществами (вводимыми путем инъекций);
• наличие воспалительного процесса в ротовой полости или в районе гениталий;
• формирование новообразований злокачественной природы;
• инфекционный мононуклеоз.

Чтобы получить достоверные сведения, сдавать кровь нужно с учетом всех врачебных рекомендаций, в противном случае возбудитель сифилиса может быть не выявлен.

Почему для диагностики сифилиса назначается именно РПГА

Часто пациенты задаются вопросом, почему при подозрении на сифилис назначают именно РПГА. Специалисты уверяют, что тестирование является столь популярным, поскольку в 99% случаев дает правильный результат.

Реакция агглютинации не произойдет, только если в организме отсутствуют антитела трепонемы, в противном случае обследование обязательно покажет их присутствие.

Медицинская практика показывает, что чувствительность теста очень высока, причем положительная реакция будет выявлена даже при скрытых стадиях заболевания. Благодаря высокой результативности тест не теряет актуальности даже в настоящее время.

Использование РПГА при других патологиях

Сдачу биоматериала на данное исследование часто назначают при подозрении на коклюш, на брюшной тиф, на иерсиниоз (острое инфекционное заболевание ЖКТ). Такая востребованность обусловлена тем, что по чувствительности и результативности РПГА превосходит практически все серологические анализы.

Тест помогает определить большую часть недугов, вызванных патогенными клетками и риккетсиями. При этом в роли антигенов можно использовать ингредиенты бактериальных вакцин, бактериальные экстракты (с коревым или коклюшным диагностикумом), очищенные антигены всевозможных микроорганизмов.

Основные преимущества метода

Данная методика активно используется по всему миру не только потому, что она является очень результативной, но и из-за определенных преимуществ:

• проведение теста не представляет сложности, от пациента требуется лишь сдать кровь;
• для проведения исследования не нужно специальное оборудование;
• исследование не занимает много времени, обычно пациенту оглашают результат в течение 24 часов;
• тест имеет высокую чувствительность и специфичность к сифилису.

Особенности проведения

Для осуществления тестирование требуется венозная кровь. Чтобы расшифровка была достоверной, пациенту необходимо ответственно подойти к подготовке к анализу и строго соблюдать врачебные советы.

• сдавать биологический материал разрешено только на пустой желудок;
• перед мероприятием (если сдача крови осуществляется днем или вечером) разрешено пить только минеральную воду без газов, употреблять жидкость нужно в небольших объемах;
• за пару часов до сдачи биоматериала запрещено курить;
• категорически запрещено употреблять спиртные напитки за двое суток до процедуры;
• если пациент принимает какие-либо лечебные препараты, об этом непременно нужно предупредить лечащего врача;
• если человек чувствует себя плохо, забор крови лучше перенести на другой день, поскольку это может негативно сказаться на расшифровке результата.

Важнейшим этапом является подбор подходящей клиники. Кровь лучше сдавать в современном диагностическом центре с хорошей репутацией.

Как долго проводится анализ?

Точно сказать, как долго делается расшифровка результатов, невозможно. Скорость ее зависит от самого типа исследования, а также от применяемого оборудования.

Чаще всего РПГА расшифровывается в течение суток, но в некоторых случаях процедура может занять от 2 до 4 дней. Если лаборатория будет сильно загружена, пациенту выдадут бланк с результатами не раньше чем через 5 суток.

Расшифровка результатов

Чтобы выявить наличие патологии, к полученной крови нужно добавить специальную сыворотку. Если в организме человека присутствуют трепонемы, произойдет реакция агглютинации, вследствие чего эритроциты выпадут в осадок.

Число склеенных эритроцитов во многом зависит от того, какое количество антител присутствует в реагенте. Пассивная гемагглютинация показывает не только присутствие антител, но также дает медику возможность определить их количество.

Положительный результат

Если тест показывает положительную реакцию, это свидетельствует о присутствии возбудителя болезни. Чтобы поставить более точный диагноз, пациента нужно направить на дополнительную лабораторную и инструментальную диагностику.

Неотъемлемым этапом обследование является проверка всех членов семьи и людей, с которыми инфицированный человек вступал в половой контакт.

Как показывает медицинская практика, примерно у 5% пациентов в ходе тестирования проявляется ложноположительная реакция, что может произойти при игнорировании подготовительного этапа, а также при:

• формировании онкологических новообразований;
• патологии соединительной ткани;
• наличии гепатита разных форм;
• ВИЧ-инфекции.

Также слабоположительный результат может проявиться при беременности. Ложная “+” реакция практически всегда сопровождается низким титром. Интересным моментом является то, что если человек хотя бы раз болел сифилисом, реакция РПГА всегда будет положительной.

Исключение составляют только те случаи, когда сифилис был выявлен на ранней стадии и после этого сразу началась интенсивная терапия.

Отрицательный результат

Тестирование дает отрицательный ответ в таких случаях:

• у пациента в организме отсутствуют патогенные микроорганизмы, являющиеся возбудителем сифилиса;
• с момента заражения прошло менее 3 недель, и иммунитет еще не начал производить антитела;
• забор крови из вены производился неправильно.

Даже если тестирование показало “-”, специалисты все же рекомендуют пройти дополнительные анализы для подстраховки, чтобы убедиться, что патогенные микроорганизмы отсутствуют.

Точность результата

Многочисленные клинические исследования подтвердили, что такое эта методика дает гарантированно правильный результат, если анализ проводился при соблюдении всех правил и пациент строго придерживался врачебных рекомендаций перед забором крови.

Если тестирование дало положительный ответ, вероятность того, что человек инфицирован сифилисом, составляет более 95% .

Неправильная реакция может проявиться только в тех случаях, если с момента инфицирования прошло слишком мало времени либо лаборант не соблюдал инструкцию при исследовании.

Что касается ложноположительного результата, то он может быть, если диагностика проводилась при наличии инфекционных заболеваний или патологических состояний.

Ложный результат отличается от истинного положительного тем, что он очень быстро становится отрицательным, если тестирование провести повторно через 2 недели.

На данный момент анализ РПГА до сих пор остается самым эффективным и достоверным тестом определения сифилиса и прочих опасных патологий. Поэтому при подозрении на наличие многих заболеваний первым делом медики направляют пациента на РПГА.

Трепонемные тесты на сифилис. Общее описание.

Чтобы достоверно диагностировать сифилис и выявить противосифилитические антитела в организме больного (в сыворотке крови или спинномозговой жидкости), используют особые технологии лабораторных исследований - так называемые серологические методы .

При проведении диагностических тестов на сифилис, применяются различные серологические реакции : агглютинации, преципитации, иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный анализ и др. В основе всех этих серологических реакций лежит взаимодействие антигенов и антител .

Специфические серологические тесты называются трепонемными потому, что в этих тестах используются бледные трепонемы или их антигены, то есть антигены трепонемного происхождения. Цель трепонемных тестов - выявление специфических антител к антигенным структурам возбудителя сифилиса, то есть антител, направленные конкретно против самих бактерий T. Pallidum, а не против тканей организма, поврежденных трепонемой. Специфические противотрепонемные антитела класса IgM могут быть обнаружены уже в конце второй недели заболевания.

7. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Положительные результаты РВ на сифилис у лиц, не страдающих этим заболеванием, называют ложноположительными. Частота ложноположительных результатов у здоровых лиц составляет 0,2-0,25 %. Если процент неспецифических ложноположительных результатов РВ у здоровых очень мал, то при некоторых заболеваниях он может быть высоким.

Все неспецифические результаты серологических реакций можно разделить на следующие основные группы:

1. Заболевания, обусловленные наличием общих антигенов у сходных возбудителей (спирохет): возвратный тиф, фрамбезия, беджель, пинта, трепонема полости рта, лептоспиры.

2. Положительные реакции, обусловленные изменением липидного обмена и изменением в глобулинах сыворотки. К ним относятся положительные результаты у беременных, больных подагрой, нарушения липидного состава в результате отравления свинцом, фосфором, после приема натрия салицилата, дигиталиса и др. В число этих реакций следует включить и положительные реакции при некоторых инфекционных заболеваниях (сыпной тиф, малярия, пневмония, лепра, эндокардит, коллагенозы, инфаркт миокарда, сотрясение мозга, онкологические заболевания, цирроз печени и др.)

3. Технические ошибки проведения. Неправильный выбор дозы комплемента, несоблюдение условий и сроков хранения реагентов, исключение из постановки реакции контрольных образцов сывороток крови, использование загрязненных пробирок и инструментов.

8. Модификация реакции Вассермана

Имеются модификации постановки реакции Вассермана в качественном и количественном вариантах, на холоде, со спинномозговой жидкостью.

Модификация РВ на холоде оказалась более чувствительной. Особенностью методики постановки реакции Вассермана на холоде является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента. Эта реакция также ставится с кардиолипиновым и трепонемным антигеном.

Кроме качественной оценки РВ, имеется метод ее количественной постановки с различными разведениями сыворотки крови (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный результат (4+). Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых форм сифилиса и при контроле за эффективностью терапии.

9. Область применения

В России РСКт входит в состав комплекса стандартных серологических реакций на сифилис (КСР).

Реакцию Вассермана с трепонемным и кардиолипиновым антигеном (РСКт) применяют для

• диагностики всех форм сифилиса,
• контроля за эффективностью лечения,
• обследования лиц, имевших половой контакт с больным сифилисом,
• обследования лиц с клиническим и анамнестическим подозрением на сифилис
• при профилактическом обследовании на сифилис больных психиатрических и неврологических стационаров, доноров и беременных, в том числе лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности.

В настоящее время, приказом Министерства Здравоохранения РФ, рекомендовано заменить РСКт на более чувствительные трепонемные методы (ИФА или РПГА).

За рубежом реакция Вассермана с трепонемальным антигеном уже давно не применяется в клинической лабораторной практике и не входит в список стандартных тестов, рекомендованных Всемирной Организацией Здравоохранения.

Комплекс классических серологических реакций (КСР)

КСР - это комплекс реакций , применяемых для серодиагностики сифилиса в качестве стандартного метода. Этот комплекс реакций включает в себя реакцию Вассермана с кардиолипиновым антигеном (экстракт из сердца быка, обогащенный лецитином и холестерином) и трепонемным антигеном (обработанная ультразвуком взвесь апатогенных культуральных бледных трепонем), а также микрореакцию преципитации (РМП) с плазмой или инактивированной сывороткой, которая ставится с кардиолипиновым антигеном

КСР становятся положительными в середине первичного периода (его деление на серонегативный и серопозитивный как раз и определяется по КСР), во вторичном периоде КСР положительны у 98-100% больных, а при третичном – лишь у 60- 70%. То есть, по мере увеличения давности заболевания позитивность КСР постепенно снижается.

Достоинства КСР:

1) Дешевизна, простота и быстрота постановки. Особенно это характерно для реакции микропреципитации: РМП в настоящее время – главный скрининговый (отборочный) метод;

2) Нетрепонемные тесты удобно использовать для контроля излеченности сифилиса.

Недостатки КСР:

1) Субъективность оценки результатов реакций («на глаз»);

2) Малая чувствительность при поздних формах сифилиса;

3) Недостаточная специфичность по сравнению с более современными тестами. При их проведении часто отмечаются ложноположительные реакции (ЛПР).

ЛПР могут быть обусловлены перекрестной реактивностью между бледной спирохетой и другими микробами, нарушениями липидного и белкового обмена, нестабильностью клеточных мембран, образованием аутоантител. ЛПР отмечаются при острых (малярия, инфекционный мононуклеоз и др.) и хронических (туберкулез, лепра, гепатит, боррелиоз и др.) инфекциях, инфаркте миокарда, циррозе печени, коллагенозах (особенно – при СКВ), онкопатологии, вакцинации, употреблении наркотиков, злоупотреблении алкоголем и жирной пищей. Ложноположительными могут быть КСР в последние недели беременности, после родов, а у некоторых женщин и во время месячных. Ложноотрицательные результаты КСР могут быть связаны с ВИЧ-инфекцией.

РИТ, РИБТ - Реакция иммобилизации бледных трепонем

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ; Treponema pallidum immobilization test, TPI) - классический метод, который служит для выявления специфических трепонемных антител. Реакция РИБТ использует в качестве антигена патогенные бледные трепонемы T. pallidum (штамм Nichols), выращенные в яичке кролика. РИБТ основывается на потере подвижности живых бледных трепонем после воздействия антител из сыворотки крови пациента и комплемента. Результаты оцениваются посредством темнопольной микроскопии. Несмотря на то, что тест РИБТ был введен в клиническую практику в качестве специфического теста на сифилис, он является трудоемким, технически сложным, времязатратным и дорогим в применении.

1. История метода РИБТ

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) является фактически первым специфическим тестом для диагностики сифилиса. Эта реакция была представлена в 1949 году американскими исследователями Нельсоном и Майером (R. W. Nelson и M. M. Mayer) и подробно рассмотрена в научных работах в последующие десятилетия. Безуспешные попытки использовать живые трепонемы в тестах предпринимались и раньше. Благодаря тому, что Нельсону удалось создать среду, в которой трепонемы сохраняли жизнеспособность до 8 дней, его исследования увенчались успехом.

2. Принцип метода РИБТ

Метод основан на феномене потери бледными трепонемами подвижности в присутствии иммобилизирующих противотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и комплемента в анаэробных условиях. Антигеном служат живые патогенные бледные трепонемы, полученные от искуственно зараженных сифилисом кроликов.

3. Постановка теста РИБТ

В реакции участвуют испытуемая сыворотка, комплемент и антиген. К живым трепонемам, полученным из тканей яичка кролика после искусственного заражения, добавляют сыворотку крови исследуемого. При наличии в сыворотке противотрепонемных антител-иммобилизинов, бледные трепонемы прекращают движение (иммобилизируются). Антитела-иммобилизины относятся к поздним антитрепонемным антителам.

Реакция ставится с инактивированными прогреванием сыворотками или с образцами сывороток, высушенных на вощеной бумаге (сухие капли). Инактивацию сыворотки прогреванием проводят 30 минут при температуре 56°С. Перед взятием крови обследуемый не должен получать медикаменты, особенно препараты пенициллина. Прием препаратов отменяют на срок их возможной задержки в организме.

В качестве антигена используются бактерии штамма Никольса, полученные из 7–10-дневного кроличьего сифилитического орхита (воспаления яичка). Период от момента постановки реакции до регистрации ее результатов длится 18-20 часов, поэтому для сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности микроорганизмов необходима среда выживания.

В РИБТ применяют комплемент морских свинок. Для получения комплемента кровь берут обязательно в условиях стерильности у нескольких морских свинок.

В случае бактериального загрязнения комплемент бракуют. Нельзя применять в реакции иммобилизации бледных трепонем консервированный комплемент, т.к. он токсичен для микроорганизмов.

В реакции иммобилизации используют избыток комплемента. Количество его в значительной степени зависит от среды выживания для бледных трепонем.

РИБТ ставят в стерильных боксах, предварительно облученных бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут. Каждую сыворотку крови исследуют в двух пробирках: опытной и контрольной . В обе пробирки вносят исследуемую сыворотку и антиген в необходимых количествах. В опытную пробирку наливают активный комплемент, а в контрольную такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. После заполнения содержимое пробирок перемешивают легким встряхиванием.

РИБТ протекает в анаэробных условиях. Пробирки с ингредиентами помещают в микроанаэростат, из которого вакуумным насосом отсасывается атмосферный воздух и нагнетается газовая смесь из баллона (95 частей азота и 5 частей углекислого газа). Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат (35°С) на 18-20 часов.

Оценку результатов РИБТ производят после извлечения пробирок из термостата и микроанаэростата (т.е. через 18-20 часов опыта). Пастеровской пипеткой на предметное стекло наносят каплю содержимого пробирки, которую накрывают покровным стеклом и исследуют в темном поле микроскопа (объектив 40, окуляр 10X). Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и отрицательной сыворотками крови, с активным и инактивированным комплементом и средой выживания для бледных трепонем. Контрольную отрицательную сыворотку крови применяют для суждения о степени подвижности бледных трепонем в данном опыте. Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в условиях данного опыта. Исследование активного и инактивированного комплемента и среды проводят для определения их влияния на подвижность бледных трепонем.

При недостатке комплемента в опыте, иммобилизирующие антитела не проявляют свою активность должным образом и трепонемы остаются подвижными. Поэтому, после опыта проводят определение остаточного комплемента, чтобы оценить, не была ли подвижность бледных трепонем в опытных пробирках обусловлена отсутствием комплемента. Для этого применяется гемолитическая система - выдержанная в термостате смесь из взвеси эритроцитов барана и разведённой гемолитической сыворотки.

Остаточный комплемент определяют добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в нужном объеме. Пробирки помещают в термостат при 37° на 45 минут. В опытных пробирках должен наступить гемолиз эритроцитов, в контрольных должна быть задержка гемолиза. Отсутствие в опытных пробирках гемолиза указывает на недостаточное количество комплемента, в этих случаях исследование надо повторить. Повторное исследование сыворотки крови не производят только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

4. Учет результатов РИБТ

Подсчет утративших подвижность, иммобилизованных трепонем ведется под микроскопом, методом темнопольной микроскопии. От исследователя требуется навык оценки движения трепонем. Ему следует обращать внимание на интенсивность движений, совершаемых бледной трепонемой. У этой бактерии не всегда можно наблюдать волнообразные сокращения и сгибательные движения, иногда только вращательные. Следует также уметь отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Для оценки результатов реакции рассчитывается процент иммобилизации бледных трепонем, т. е. соотношение подвижных и неподвижных трепонем в опыте (с активным комплементом) и контроле (с неактивным комплементом) по формуле:

X = (М – С)×100/М

где М - количество подвижных трепонем в контроле; С - количество подвижных трепонем в опыте; X - % иммобилизации. В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице с применением вышеуказанной формулы.

Реакция иммобилизации бледных трепонем оценивается как

• положительная при иммобилизации 51 - 100% трепонем,
• слабоположительная: 31 - 50% неподвижных трепонем,
• сомнительная: 21 - 30% неподвижных трепонем,
• отрицательная: 0 - 20% неподвижных трепонем.

Реакция иммобилизации бледных трепонем становится положительной в конце первичного – начале вторичного периода сифилиса (с 7-8-й недели от момента заражения и более). Вместе с тем РИБТ малопригодна для диагностики ранних стадий сифилиса, поскольку антитела, иммобилизирующие бледные трепонемы и определяемые в реакции, появляются только через 3-6 недель после заражения. Антитела-иммобилизины относятся к классу иммуноглобулинов IgG. Они появляются в крови позже реагинов (антикардиолипиновых антител), позже антител-флюоресцинов (выявляются РИФ и ИФА) и преципитинов (выявляются РМП).

В дальнейшем РИБТ остается положительной. Отмечается высокая чувствительность реакции при поздних формах сифилиса. При вторичном, позднем сифилисе, нейросифилисе, врожденном сифилисе положительный результат РИБТ регистрируется в 95–100 % случаев. При третичном сифилисе, при специфических поражениях внутренних органов, нервной системы, когда РВ часто отрицательная, РИБТ дает положительные результаты в 98 - 100% случаев.

РИБТ долгое время признавалась самым специфичным тестом на сифилис. По данным литературы, специфичность РИБТ равна 99 %, чувствительность колеблется от 79 до 94 %. По данным ЦНИКВИ, чувствительность РИБТ (суммарно, по всем стадиям сифилиса) составляет 87,7%.

7. Область применения метода

Сфера применения РИБТ постепенно сужается из-за длительности постановки, дороговизны и трудоемкости. РИБТ - это достаточно сложный и затратный анализ, требующий высокой квалификации персонала и наличия вивария. В связи с этим применение данного метода в последние годы существенно сократилось. В США этот тест в настоящее время применяется только в исследовательских лабораториях.

Исходя из сложности и дороговизны РИФ и РИБТ, имеет смысл применять их для диагностики поздних и скрытых форм сифилиса. РИБТ сохраняет свои позиции как «реакция-арбитр» при дифференциальной диагностике ранних скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов. Эта реакция может быть полезн при диагностике нейросифилиса и при расхождении результатов других серологических тестов.

РИБТ становится положительной значительно позже, чем РИФ и РВ. Поэтому для диагностики заразных форм сифилиса она не применяется.

РИБТ, как и РИФ, очень медленно негативируется в процессе противосифилитической терапии. Вследствие этого она непригодна для контроля за ходом противосифилитической терапии.

Ложноположительные результаты (ЛПР) при РИБТ редки и отмечены главным образом при ряде трепонематозов (фрамбезия, пинта, беджель), не встречающихся в России, а также при лепре, саркоидозе, СКВ, туберкулезе, циррозе печени и некоторых других редких заболеваниях несифилитической природы. С возрастом пациентов число ложноположительных результатов РИБТ увеличивается.

РИБТ может оказаться ложноположительной, если в исследуемой сыворотке содержатся трепонемоцидные вещества (например, пенициллины, тетрациклины, эритромицин), вызывающие неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем, Это может быть следствием приема трепонемоцидных антибиотиков пациентом, поэтому обследование не проводят лицам, получавшим антибиотики в течение последнего месяца. Кровь на РИБТ можно исследовать не ранее 2 недель после окончания приема антибиотиков и других противосифилитических препаратов.

9. Модификации реакции иммобилизации бледных трепонем

Помимо микроанаэростатной методики существует меланжерная постановка РИБТ по Н.М. Овчинникову. Анаэробные условия при постановке реакции создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты резиновым кольцом. Меланжерная методика реакции позволяет обходиться без вакуумного насоса, баллона со смесью азота и углекислого газа, микроанаэростата. При сравнительном изучении на большом клиническом материале получены результаты, не уступающие классической анаэростатной методике.

10. Особенности, преимущества и недостатки РИБТ

РИБТ - это технически сложный и дорогостоящий метод диагностики. Технология требует значительных средств для содержания кроликов и проведения тестирования. Этот трудоемкий тест в настоящее время он применяется в основном для научных целей. В большинстве зарубежных стран уже почти 40 лет РИБТ практически используется не для диагностических целей, а только в научно-исследовательской работе.

Недостатки реакции:

• РИБТ требует работы с живыми патогенными бледными трепонемами штамма Никольс, остающегося заразным для человека несмотря на адаптацию для кроликов
• постановка реакции сложна, трудоемка и дорогостояща
• необходимо наличия вивария
• требуется высококвалифицированный персонал для постановки реакции, учета результатов и содержания вивария
• субъективность оценки результатов
• отсутствие автоматизации
• нет возможности стандартизировать этот серологический метод.
• реакция неприменима на фоне проводимой антисифилитической терапии
• невозможность использовать для контроля излеченности. РИБТ у больных сифилисом может оставаться положительной в течении многих лет (и даже – пожизненно), несмотря на полученное полноценное лечение.
• реакция может давать ложноположительные результаты у больных злокачественными опухолями, диабетом, лепрой, аутоиммунными заболеваниями, пневмонией, тяжелой сердечно-сосудистой патологией.

Достоинствами РИБТ являются:

1) Достаточно высокая чувствительность;

2) Высокая специфичность.

РИФ (Реакция иммунофлюоресценции)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - метод экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Тесты, основанные на детекции флюоресцентного сигнала, считаются одними из лучших тестов на сифилис.

1. История метода

Трепонемный флюоресцентный тест - реакция иммунофлюоресценции - РИФ (Fluorescent treponemal antibody, FTA) был впервые разработан в 1957 г. Deacon и соавторами (Deacon, Falcone and Harris).

2. Принцип метода

Метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета

В качестве антигена в РИФ используется взвесь живых патогенных бледных трепонем штамма Никольс из орхита кролика, которая высушивается на предметном стекле и фиксируется ацетоном. К высушенным и фиксированным ацетоном к стеклу бледным трепонемам добавляется сыворотка крови больного.

После промывания препарат обрабатывается сывороткой, содержащей антитела против иммуноглобулинов человека, меченные флюоресцином. Еще раз промывают препарат и смотрят его под люминесцентным микроскопом. Если в исследуемой сыворотке есть противотрепонемные антитела-флюоресцины, будет отмечаться желто-зеленое свечение трепонем.

3. Способ проведения исследований методом РИФ

Фиксированный на предметном стекле антиген (патогенные бледные трепонемы) обрабатывается испытуемой сывороткой. После промывания препарат обрабатывается люминесцентной сывороткой против иммуноглобулинов человека, меченной флюорохромом. При этом образующийся флюоресцирующий комплекс (античеловеческий глобулин + флюоресцеин тиоизоционат) связывается с человеческим глобулином на поверхности бледной трепонемы, обеспечивая свечение бледной трепонемы под люминесцентным микроскопом.

Для выявления комплексов антиген-антитело применяют люминесцирующую сыворотку, представляющую конъюгированные с ФИТЦ антивидовые (противочеловеческие) иммуноглобулины. Наличие в сыворотке антител к трепонемам определяют по свечению трепонем при исследовании в люминесцентном микроскопе. Тест проводят в качественном и полуколичественном вариантах.

4. Учет результатов

Визуализация результатов РИФ проводится с помощью люминесцентного микроскопа. Результаты оцениваются по степени свечения трепонем в препарате. При наличии антител видно свечение трепонем, если же в сыворотке не было противотрепонемных антител, то трепонемы не видны. Степень свечения фиксированных к стеклу высушенных бледных трепонем обозначаются в «плюсах» (от «–» до «++++»). Отрицательный результат - отсутствие свечения или уровень фона - 1+.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) достаточно чувствительна на всех стадиях инфекции, с окончания периода инкубации до позднего сифилиса. Первичный период сифилиса при классическом течении начинается через 3-4 недели после заражения. РИФ становится положительной в первые дни первичного периода или даже в конце инкубационного периода, с 3-й недели после инфицирования. Результаты РИФ остаются положительными во всех периодах, в том числе при поздних формах.

РИФ становится положительной несколько раньше, чем РВ. По некоторым данным, положительная РИФ бывает у 80% больных первичным серонегативным сифилисом. Во вторичном периоде РИФ положительная почти в 100% случаев. Она всегда положительная при латентном сифилисе и дает 95 - 100% положительных результатов при поздних формах заболевания и врожденном сифилисе.

6. Чувствительность и специфичность

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – это группа методов, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. РИФ чувствительна во всех стадиях инфекции, начиная от периода инкубации и заканчивая поздним сифилисом. По данным ВОЗ, чувствительность РИФ при первичном сифилисе – 70-100%, при вторичном и позднем – 96–100%, специфичность – 94–100%. По данным ЦНИКВИ, чувствительность РИФ при всех формах сифилиса составляет 99,1%.

Специфичность РИФ может быть повышена путем предварительной обработки исследуемой сыворотки сорбентом - ультраозвученным трепонемным антигеном, связывающим групповые антитела (РИФ-абс).

7. Область применения метода

РИФ применяется:

• как подтверждающая реакция при раннем, скрытом сифилисе
• при установлении ретроспективного диагноза
• для дифференциации скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов исследований на сифилис.
• как подтверждающий тест при нейросифилисе.

РИФ достаточно широко используют в качестве подтверждающего теста, но она не предназначена для рутинного использования или скрининга, поскольку в  техническом отношении трудна для постановки. Для выполнения РИФ необходимо наличие вивария или приобретение взвеси патогенных бледных трепонем, что ограничивает возможности реакции. Однако в последние годы на отечественном рынке начали появляться тест-системы, позволяющие проводить реакцию при отсутствии вивария и собственного лабораторного штамма патогенных бледных трепонем.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

ЛПР при постановке РИФ бывают редко (при коллагенозах, боррелиозе).

РИФ до сих пор считают одним из лучших тестов на сифилис, «золотым стандартом» серодиагностики. РИФ в сравнении с РИБТ более проста в постановке,

Несмотря на высокую диагностическую ценность, широкому внедрению РИФ в повседневную практику препятствуют необходимость использования живой T. pallidum, высокая стоимость и длительность проведения исследования. Постановка реакции трудоемка. Кроме того, оценка результатов РИФ носит субъективный характер.

Достоинствами РИФ и РИБТ являются:

1) Высокая чувствительность (особенно для РИФ);

2) Высокая специфичность (особенно для РИБТ).

Недостатки РИФ и РИБТ:

1) Техническая сложность, дороговизна методов.

2) Субъективность оценки результатов, отсутствие автоматизации;

3) РИФ и РИБТ у больных сифилисом могут оставаться положительными в течении многих лет (и даже – пожизненно), несмотря на полученное полноценное лечение. Поэтому эти реакции невозможно использовать для контроля излеченности.

10. Модификации метода

На практике для серодиагностики сифилиса используется и использовалось несколько модификаций реакции иммунофлюоресценции:

• РИФ-абс – наиболее чувствительный метод серодиагностики сифилиса, становится позитивным раньше других реакций (с 3-ей недели от заражения);
• РИФ-200 (сыворотка пациента при постановке разводится в 200 раз) – высоко специфичный метод серодиагностики сифилиса.
• РИФ-10 (разведение испытуемой сыворотке в 10 раз) - более чувствительный метод, чем РИФ-200.
• РИФ-ц проводят с ликвором.
• РИФ-абс-IgM - выявление ранних противотрепонемных антител класса IgM.

1. Наибольшее распространение получила модификация РИФ-абс - реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией. Перед постановкой реакции сыворотка обследуемого истощается смесью непатогенных трепонем для исключения перекрестных реакций. Групповые антитела удаляются из исследуемой сыворотки с помощью разрушенных ультразвуком культуральных трепонем, что существенно повышает специфичность реакции. Поскольку исследуемая сыворотка используется в разведении 1:5, то РИФ-абс отличается высокой чувствительностью.

Основными показаниями для использования РИФ-абс в клинической практике являются:

• диагностика скрытых и поздних форм сифилиса,
• выявление ложноположительных результатов КСР и РМП, особенно у беременных и соматических больных при подозрении на сифилис,
• для установления ретроспективного диагноза заболевания.

РИФ-абс мало информативна при оценке результатов лечения: у 85 % больных, получивших адекватную противосифилитическую терапию, положительные результаты РИФ сохраняются многие годы.

Эту реакцию называют «золотым стандартом» серодиагностики сифилиса. Ее используют для арбитражных случаев, но для достоверного результата необходима свежая концентрированная взвесь T. pallidum штамма Nichols из семидневного орхита у кролика, которую нельзя замораживать.

2. В СССР ставилась в двух модификациях - РИФ-10 и РИФ-200 , т. е. с разведением испытуемой сыворотки в 10 и 200 раз. РИФ-200 - исследуемая сыворотка разводится в 200 раз для уменьшения количества ложноположительных результатов. Это обеспечивает высокую специфичность реакции, но чувствительность ее несколько падает. РИФ-10 более чувствительна, но чаще дает неспецифические положительные результаты, чем РИФ-200, отличающаяся высокой специфичностью. РИФ-10 более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны.

Чувствительность РИФ-200 и РИФ-абс оценивается 84–99 %, а специфичность - 97–99 %.

3. РИФ-ц проводят с ликвором. Реакция ставится с использованием цельной спинномозговой жидкости для выявления специфических поражений ЦНС.

4. Реакция РИФ-абс-IgM предложена для выявления ранних противотрепонемных антител класса IgM. Эта реакция может использоваться для диагностики врожденного сифилиса, ранних форм сифилиса и дифференциальной диагностики случаев реинфекции и серорецидива.

Известны 2 модификации этой реакции:

– FTA-ABS-IgM, основанная на использовании во второй фазе реакции конъюгата анти-IgM (меченные флюоресцеином антитела к IgM человека) вместо античеловеческого флюоресцирующего глобулина;

– российский вариант РИФ-абс-IgM, отличающийся тем, что к исследуемой сыворотке крови добавляется сорбент, удаляющий IgG-антитела, а с оставшимися IgM-антителами ставится РИФ-абс.

Основными показаниями к постановке РИФ-абс-IgM являются:

– серодиагностика врожденного сифилиса при отсутствии у ребенка манифестных проявлений врожденного сифилиса на коже и слизистых оболочках;

– дифференциальная диагностика реинфекции и клинико-серологического или серологического рецидива сифилиса, при котором РИФ-абс-IgM будет отрицательной, а РИФ-абс - положительной;

– оценка эффективности терапии раннего приобретенного или врожденного сифилиса: после адекватного лечения РИФ-абс-IgM становится отрицательной в течение ближайших 3–6 месяцев.

Эта реакция может использоваться для выявления врожденного сифилиса. Известно, что крупные молекулы IgM не могут проходить через здоровую плаценту. Следовательно, антитела класса М против бледной трепонемы могут появиться в организме ребенка или вследствие нарушения барьерной функции плаценты или же они вырабатываются организмом ребенка, больного сифилисом. Антитела класса IgM появляются в крови больного сифилисом уже в первые недели болезни, а антитела класса IgG появляются позже. Раздельное определение антител обоих классов оказывается исключительно полезным при диагностике врожденного сифилиса у детей, так как наличие у ребенка на первом месяце жизни антител класса IgM будет указывать, что они образованы организмом больного сифилисом ребенка, в то время как выявление только антител IgG будет говорить о материнском происхождении последних.

Постановка реакции 19S(IgM)-РИФ-абс предполагает предварительное разделение c помощью гель-фильтрации более крупных молекул 19S IgM от

фракции более мелких молекул 7S IgG. Дальнейшее исследование в реакции РИФ-абс сыворотки крови, содержащей только фракцию 19S IgM,

устраняет все возможные источники ошибок. Но техника постановки этой реакции сложная и трудоемкая, требует специального оборудования и подготовки специалистов.

Реакция иммунного прилипания (РИП, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Эта реакция основана на использовании феномена, который в 1912 г. описал Rieckenberg. РИП основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

Для постановки реакции используются следующие ингредиенты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса.

Наиболее широко применительно к серодиагностике сифилиса этот тест изучался отечественными и зарубежными авторами в 50-60-е годы. Данные о ценности РИП как диагностического теста были противоречивы. Реакция требовала максимальной точности, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке исследуемого материала в препарате получались недостоверные результаты.

В России обширные исследования провела Л.В. Сазонова, которая получила близкие результаты в РИП и РИТ при использовании свежеприготовленной взвеси патогенных бледных трепонем штамма Никольса. Однако применение прогретого или консервированного фенолом антигена резко искажало результаты реакции и делало антиген нестабильным. Рекомендовать данный тест для замены РИТ Л.В. Сазонова сочла невозможным.

Г.П. Авдеева, применив при изготовлении антигена другие температурный и временной режимы, получила при изучении РИП иные результаты. По ее данным, чувствительность этой реакции выше чувствительности KCP и РИТ, но несколько уступает РИФ, а специфичность РИП, РИТ и РИФ близка.

Однако отсутствие производственного выпуска антигена для РИП не позволило более широко изучить этот тест и внедрить его в практику.

РПГА-реакция пассивной гемагглютинации

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является распространенным серологическим тестом, прочно укоренившимся в лабораторной практике. обладает достаточно высоким уровнем эффективности при исследовании.

1. История метода РПГА

Впервые о применении РПГА для диагностики сифилиса сообщили G.Blumental и W.Bachman (1932). В 1965 г, для диагностики сифилиса была предложена реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации. О модификации реакции с использованием различных антигенов сообщалось Ratlev Т. в 1965 - 1967 гг. Микромодификацию РПГА предложили Сох Р.М. и соавторы в 1969 году. Первую коммерческую тест-систему разработали японские ученые Tomisava et. al. в 1969 г.

2. Принцип метода РПГА

Из подготовленной однородной взвеси эритроцитов, «нагруженных» антигенами, при добавлении исследуемой сыворотки, содержащей антитела, выпадает осадок в виде хлопьев. Полученный осадок состоит из эритроцитов, "склеенных" антителами, и называется «гемагглютинат» . Взвесь эритроцитов подготавливается заранее и поставляется в составе диагностических тест-систем.

Процесс склеивания эритроцитов, на поверхности которых присутствуют антигены, называется «гемагглютинация». Склеивание происходит под действием специфических антител (агглютининов). Реакция называется «пассивной» , т.к. собственные антигены эритроцитов не вступают в реакцию, а сами эритроциты выполняют исключительно вспомогательную индикаторную функцию.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации - это разновидность реакции агглютинации, в которой в качестве носителей антигенов используются именно эритроциты (от греч. háima - кровь), а не другие частицы. В общем случае, в реакции агглютинации под действием антител происходит склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток - не обязательно эритроцитов, а, например частиц латекса, бактерий или других антигеннесущих корпускулярных частиц.

При реакции пассивной гемагглютинации для диагностики сифилиса, в качестве антигена используются эритроциты барана или птиц, покрытые антигенами бледных трепонем. При добавлении сыворотки, содержащей специфические антитела, происходит склеивание эритроцитов (агглютинация).

Реакцию РПГА относят к иммунологическим методам, т.к. она основана на специфическом взаимодействии антигена патогенной бледной трепонемы с антителом. В соответствии с «теорие решетки» агглютинация является результатом «сшивки» поверхностных молекул антигена молекулами антител (иммуноглобулинов).

3. Постановка реакции пассивной гемагглютинации

РПГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Процесс соединения антигена с эритроцитами называют сенсибилизацией, а полученный таким образом искусственный корпускулярный антиген - сенсибилизированными эритроцитами. Эритроцитарными диагностикумами называются эритроциты, сенсибилизированные антигеном.

Для приготовления диагностикума применяют обработанные вначале формалином, затем танином эритроциты барана или птиц (чаще куриные), которые подвергают сенсибилизации ультра-озвученным антигеном патогенной бледной трепонемы (штамм Никольса) или рекомбинантными белками бледной трепонемы (TpN15, TpN17, TpN47). Также могут использоваться эритроциты барана, сенсибилизированных ультраозвученным антигеном культуральных бледных трепонем.

Исследуется только сыворотка (не использовать плазму крови) . Не подходят гемолизированные и мутные образцы. Отрицательным контролем служат несенсибилизированные эритроциты (для исключения наличия антиэритроцитарных антител). В каждой серии постановок используют положительный и отрицательный контроль.

В лунки (ячейки) иммунологического планшета вносят образцы исследуемой сыворотки крови и тест-эритроциты. Если в сыворотке крови пациента содержатся специфические противотрепонемные антитела, то при добавлении исследуемой сыворотки в лунку с антигеном происходит образование комплексов "антиген-антитело", связанных с поверхностью носителей (эритроцитов). Визуально это проявляется склеиванием эритроцитов, т. е. гемагглютинацией, которая видна невооруженным глазом. Иммунные комплексы "антитело-антиген-эритроцит", которые под действием сил тяжести постепенно опускаются вниз, распределяются по всей поверхности дна лунки и формируют характерную картину «перевернутого зонтика».

В зависимости от количества антител, содержащихся в исследуемом образце, изображение «перевернутого зонтика» варьируется от максимального, занимающего всю поверхность дна лунки, до небольшого участка в центральной, самой низко расположенной его части (с просветлением в центре и формированием более интенсивного кольца из осевших эритроцитов по периферии).

Иммунные комплексы не образуются, если в образце нет специфических антител или при добавлении в реакцию контрольных (интактных) эритроцитов. При этом, эритроциты постепенно собираются в самой нижней точке дна лунки, формируя фигуру в виде компактного пятна или «пуговки», иногда с незначительным просветлением в центре.

Если сыворотка крови человека содержит антиэритроцитарные антитела, то «зонтик» сформируется в любом случае - как в реакции с тест-эритроцитами, так и с контрольными эритроцитами. В этом случае для выявления специфических антитрепонемных антител рекомендуют применять другие медицинские технологии.

Возможен феномен прозоны (невозможность реакции из-за избытка антител), устраняемый разведением сыворотки.

4. Учет результатов реакции пассивной гемагглютинации

Результаты РПГА учитывают визуально через 60-120 минут при постановке микрометода и через 2–4 ч или на следующий день при постановке макроварианта. При использовании более крупных (ядросодержащих) эритроцитов птиц получают более четкую картину, учет результатов проводят в более ранние сроки.

Возможно определение титра (высокий титр РПГА ≥ 1:2 560).

Результаты исследования оцениваются по 4+ системе (от «–» до «++++») по величине образовавшейся пленочки. При появлении агглютинации эритроциты располагаются на поверхности лунки в виде «зонтика», а при отрицательном результате эритроциты свободно соскальзывают вниз и скапливаются на дне в центре лунки в виде «пуговки».

Общепринятая оценка результатов РПГА:

4+ - положительная РПГА. Агглютинированные эритроциты в виде «зонтика» равномерно выстилают всю поверхность лунки;

3+ - положительная РПГА. Эритроциты выстилают всю поверхность лунки, но часть их «соскальзывает» к центру. При этом по периферии осадка формируется заметное кольцо;

2+ - слабоположительная РПГА. Эритроциты образуют пленку на небольшом участке нижней части лунки, формируя плотное кольцо из осадка эритроцитов с заметным просветлением в центре;

1+ - неопределенная РПГА, эритроциты образуют рыхлый осадок на дне лунки с нечеткими краями и незначительным просветом в центре;

(–) - отрицательная РПГА, все эритроциты лежат на дне лунки в виде компактного осадка («пуговки» или колечка) на чистом окружающем фоне (без окружающего зернистогоосаждения).

В зарубежной практике результаты РПГА также оценивают как реактивные (в случае образования агглютината), слабореактивные (если образования незначительны) и нереактивные (если не наблюдается агглютинации).

Учет результатов реакции может производиться автоматически с применением специальных анализаторов. Помимо качественного исследования, во всех тест-системах предусмотрен количественный анализ с определением титра.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать РПГА

РПГА становится положительной в середине первичного периода (7-8 недель от момента заражения, через 3–4 недели после появления твердого шанкра) и после лечения годами сохраняется положительной.

При очень высоком уровне антител к трепонеме в исследуемой сыворотке (что наиболее характерно для вторичного сифилиса) возможен ложноотрицательный результат РПГА (так называемый феномен «прозоны»).

Специфические антитела-агглютинины выявляются в крови переболевших сифилисом людей в течение длительного времени, поэтому РПГА не может быть рекомендована для дифференциальной диагностики реинфекции или определения остроты инфекционного процесса.

РПГА не применяется для контроля излеченности, т.к. может оставаться положительной спустя много лет после выздоровления. Вместе с тем ее можно использовать как дополнительный (к РМП или к RPR) метод при контроле эффективности проведенного лечения, исследуя динамику снижения титров антител. Обязательным условием при этом является использование той же РПГА тест-системы, что и при первом (до лечения) обследовании пациента, а также проведение исследования в той же лаборатории.

6. Чувствительность и специфичность РПГА

РПГА считается высокочувствительным и специфичным тестом. Эта реакция является ценным диагностическим тестом при всех формах сифилиса, но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания. В зависимости от стадии заболевания чувствительность РПГА колеблется. При первичном сифилисе чувствительность РПГА составляет 76% (и выше), при вторичном сифилисе – до 100%. При скрытом раннем - 97 %, при позднем сифилисе - 94 %, со специфичностью 98–100%. Более низкая чувствительность при свежих формах заболевания объясняется более поздним формированием агглютининов.

По данным ГУ «ЦНИКВИ Росздрава» чувствительность РПГА при диагностике различных форм сифилиса составила 99,4%. Большинство исследователей отмечают 98-99% специфичность РПГА.

По чувствительности и специфичности РПГА не уступает, а при поздних формах и врожденном сифилисе даже превосходит РИФ и РИБТ.

7. Область применения метода РПГА

РПГА может применяться в качестве как скринингового, так и подтверждающего теста; может быть использована в полуколичественном варианте с расчетом титра антител. Разработаны количественный метод постановки РПГА, микрометод, а также автоматизированная реакция микрогемагглютинации.

8. Особенности, преимущества и недостатки РПГА

По данным литературы, РПГА стабильно заняла лидирующее место в клинической практике в большинстве стран мира. РПГА –  наиболее  широко  используемый  тест  в  клиниках ИППП за  рубежом. 

Методика РПГА проста в выполнении, не требует специального оборудования: для ее постановки нужен лишь планшет для гемагглютинации. Исследование не занимает длительного времени; реакция высоко чувствительна и специфична. Апробация метода в клинической практике показала, что он является исключительно простым, дешевым и чувствительным. Как и ИФА, РПГА проста в исполнении, не требует высокой квалификации персонала и специального оборудования, возможна ее автоматизация.

Преимущества РПГА-теста:

• простой в постановке и интерпретации, 
• не требует специального оборудования, 
• время получения результата – 45 минут, 
• пригоден для массового скрининга (необходимо всего 25 мкл сыворотки в разведении 1:20), 
• высокая степень стандартизации, 
• наличие внутренних контролей, 
• большой срок годности, 
• приемлемая цена 
• возможность автоматизации учета. 

Следует отметить также недостатки РПГА: 

• возможность неспецифических реакций при наличии антиэритроцитарных антител, 
• отсутствие корреляции титра и стадии сифилиса,
•  более поздняя позитивация реакции на ранних стадиях сифилиса, 
• возможность ложноположительных реакций у лиц, принимавших алкоголь, наркоманов, 
• чувствительность к вибрации и температуре в лаборатории.

Преимуществами РПГА по сравнению с РИБТ и РИФ являются:

• использование промышленных тест-систем,
• возможность автоматизации реакции,
• нет необходимости работать с живой бледной трепонемой,
• отпадает потребность в виварии.

9. Источники и причины ошибок при постановке РПГА, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Реакция пассивной гемагглютинации является относительно несложным исследованием; при ее выполнении необходимо соблюдать все рекомендации производителей диагностикума и правила работы в клинико-диагностической лаборатории. Допущенные ошибки могут приводить к появлению и регистрации как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции. Ложноположительные результаты РПГА могут быть обусловлены влиянием человеческого фактора и факторов биологической природы.

Ложноположительные результаты могут быть получены

• при исследовании сывороток крови пациентов с невенерическими трепонематозами,
• за счет ревматоидного фактора
• за счет перекрестно реагирующих с трепонемным антигеном антител, образующихся при различных системных или индуцированных лекарствами и наркотиками нарушениях обмена,
• из-за аномального уровня иммуноглобулинов;
• у новорожденных детей - за счет образования в организме плода или ребенка IgM-антител к IgG матери, что осложняет трактовку результатов и диагностику врожденного сифилиса.

Ошибки, вызванные влиянием фактора участия человека на исследование:

• загрязненные микропланшеты
• неправильное пипетирование
• наличие вибрации в лаборатории
• температура воздуха в лаборатории выходит за диапазон температуры: 18–25 градусов

К наиболее типичным техническим ошибкам при постановке РПГА, приводящим к получению недостоверных результатов, следует отнести:

• неточное разведение ингредиентов,
• нарушение температурного режима,
• нарушение времени инкубации реагентов,
• нарушение сроков нанесения реагентов на планшет,
• несоответствие рН растворов требуемым,
• загрязнение лабораторной посуды.

Источником ошибок при постановке РПГА могут являться и следующие технические моменты:

• исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови;
• неравномерная концентрация эритроцитов в диагностикуме вследствие недостаточного его перемешивания перед использованием;
• нарушение сроков и условий хранения диагностикума и контрольных эритроцитов; использование наборов с истекшим сроком годности;
• использование при постановке реакций загрязненных пробирок, наконечников пипеточных дозаторов, пипеток, иммунологических планшетов, растворов;
• неточности при первичном разведении образца сыворотки крови;
• недостаточная тщательность выполнения последовательных двукратных разведений;
• несоблюдение температурного режима и времени инкубации;
• наличие посторонних вибраций и встряхиваний иммунологического планшета во время инкубации;
• нарушение методики постановки РПГА, выражающееся в отказе от выполнения исследования с контрольными эритроцитами.

Применение плазмы крови, содержащей антикоагулянты, способные вызывать неспецифическую агглютинацию эритроцитов (РПГА), может привести к получению результатов, не подлежащих трактовке.

Число ложноположительных и ложноотрицательных результатов меньше, чем при других серологических тестах. ЛПР при постановке РПГА бывают редко и возможны при трепонематозах (фрамбезия, беджель, пинта). Также, ложноположительные результаты регистрировались (в сумме менее 1 %) у наркоманов, у больных инфекционным мононуклеозом, боррелиозом, лепрой, при коллагенозах, циррозе печени, лимфосаркоме, а также у беременных.

Ложноотрицательные результаты реакции могут быть обусловлены конкуренцией между IgM- и IgG-антителами. Также ложноотрицательные результаты возможны у ВИЧ-инфицированных пациентов.

10. Модификации метода РПГА

Существует микро- и макромодификации постановки РПГА, чаще используется первая из-за экономичности, быстроты постановки и учета результатов.

Кроме того, разработан автоматический диагностический комплекс анализа изображений, что позволило производить количественную автоматическую оценку результатов и исключить субъективизм в интерпретации полученных данных. Аппаратно-программный комплекс распознает изображение, проводит обработку данных и выдает ответ в относительных единицах. 

Для автоматизации учета результатов РПГА также используются ридеры и автоматические анализаторы.

ТРРА (Treponema pallidum particle agglutination) - реакция агглютинации искусственных частиц для выявления антител к Treponema pallidum

Краткое описание теста TPPA

В настоящее время для диагностики сифилиса применяют также модификацию метода пассивной гемагглютинации - ТРРА (Treponema pallidum particle agglutination), в которой антиген бледных трепонем фиксирован на желатиновых частицах. Так как на искусственных полимерных частицах нет собственных антигенов, обусловливающих биологическую активность, то наборы для серодиагностики сифилиса на их основе имеют основания считаться более совершенными. Использование биологически инертных искусственных частиц сводит к минимуму неспецифическую агглютинацию, обычно наблюдаемую при использовании других носителей.

TPPA используется для серологической диагностики антител к различным видам и подвидам патогенных трепонем. Этот тест может использоваться для определения антител к возбудителям сифилиса, пинты, беджеля и фрамбезии.

Процедура исследования весьма проста и не требует специального оборудования - используются стандартные «U»-образные микропланшеты. В основе теста лежит агглютинация желатиновых частиц, сенсибилизированных антигенами T. pallidum, антителами, содержащимися в сыворотке крови пациента.

TPPA - это подтверждающий трепонемный тест, который удобно использовать как для исследования малого числа образцов, так и для массового скрининга. TPPA используется за рубежом в качестве подтверждающего теста и для замены микро-гемагглютинационного теста MHA-TP (microhemagglutination assay for antibodies to T. pallidum).

Чувствительность теста TPPA составляет от 85% до 100%, а специфичность - от 98% до 100%. Чувствительность TPPA для первичного сифилиса - 88%, для вторичного и позднего скрытого сифилиса 98%-100%.

Если TPPA используется для диагностики сифилиса, то антитела к другим видам трепонем (таким, как T. pallidum endemicum, pertenue, или carateum) могут вызвать ложноположительные результаты. Существует ряд методов, позволяющих удалить эти антитела из сывороточных образцов перед началом теста.

Принцип теста TPPA

TPPA - это метод пассивной агглютинации желатиновых частиц в сыворотке или плазме крови человека. Сыворотка, содержащая антитела к патогенной трепонеме, реагирует с желатиновыми частицами, сенсибилизированными антигеном бледных трепонем штамма Никольса, подвергнутых действию ультразвука. В результате реакции, в лунке планшета для микротитрования формируется гладкая пленка агглютинированных желатиновых частиц.

Если антитела отсутствуют, то частицы оседают на дно лунки планшета, формируя компактную «пуговку» из неагглютинированных частиц. Контрольные лунки с несенсибилизированными желатиновыми частицами должны также показать такую компактную «пуговку» для каждой сыворотки, то есть отсутствие агглютинации.

Применение теста TPPA

ТРРА - это тест универсального назначения, который может одинаково успешно применяться как при обязательном профилактическом обследовании групп населения на сифилис (скрининге), так и в специализированных дерматовенерологических учреждениях. Достоинством теста TPPA является его высокая чувствительность, не уступающая классическим тестам, которые до недавнего времени являлись «золотым стандартом» серодиагностики сифилиса. Среди других достоинств теста - высокая воспроизводимость, а также простота и скорость постановки реакции.

Тест TPPA применяется для подтверждения положительных результатов нетрепонемных скрининговых тестов на сифилис, таких, как тест VDRL, а также для обследования пациентов с отрицательными результатаи нетрепонемных тестов, но имеющих признаки или симптомы, указывающие на поздний сифилис. Не рекомендуется использование TPPA в качестве единственного скринингового теста на сифилис.

Кроме того, агглютинационный тест ТРРА может использоваться для исследования образцов спинномозговой жидкости при диагностике нейросифилиса. При этом, как и в отношении других серологических тестов, интерпретация результатов должна проводиться при обязательном сочетании с другими показателями и симптомами заболевания.

Результаты теста TPPA

Оценка результата происходит по системе «плюсов» - от (–) до (2+). Результаты теста видны невооруженным глазом и интерпретируются следующим образом:

Учет результатов производят, чтобы определить соответствие описанию выше. Образцы, показавшие неопределенный результат (±) необходимо исследовать повторно. В случае, если в нескольких тестах методом TPPA образец показывает неопределенный результат, рекомендуется провести исследование с помощью других методов.

Результаты анализа не следует рассматривать изолированно. Например, на ранней стадии инфекции число антител ещё слишком незначительно, вследствие чего TPPA и многим другим методам не хватает чувствительности. Поэтому, в случае подозрения на сифилис, даже если результаты тестов отрицательны, образцы необходимо исследовать ещё раз. Для постановки диагноза необходимо учитывать клинические симптомы, имеющиеся у пациента, клиническую историю и другие данные.

Так же, как и в реакции РПГА, для TPPA может наблюдаться феномен прозоны и ложноотрицательный результат в случае, если образец сыворотки содержит слишком высокий титр антител.

ИФА - Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА; The enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) является одним из многочисленных методов серологической диагностики инфекционных заболеваний. Иммуноферментный анализ (ИФА) в серодиагностике сифилиса - это тест на антитела классов M, G и A (IgM, IgG, IgA) против антигенов бледной трепонемы. Возможна постановка ИФА с ликвором.

Внедрение в практику иммуноферментного анализа (ИФА) вместо реакции Вассермана и других кардиолипиновых тестов значительно повысило качество лабораторной диагностики сифилиса. Существенным преимуществом данного метода является возможность автоматизации процесса исследования, что позволяет снизить влияние человеческого фактора.

1. История метода ИФА

Основные принципы иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя разработали E.Engvar и соавтор. (1971), B.Van Weeman и A.Schuurs (1971). Разработанный ими иммуноферментный анализ впервые был предложен для диагностики сифилиса в 1975 г. J. Veldkamp и A. Visser, которые оценили потенциал этого автоматизированного теста. ИФА начал повсеместно использоваться в диагностике сифилиса в 1980-е гг., когда были разработаны и сертифицированы диагностические тесты и стандартизированы методики тестирования. В СССР методику постановки ИФА для диагностики сифилиса разработали B.Н.Беднова, А.В.Бабий и А.В.Котровский (1982, 1983).

2. Принцип метода ИФА

Иммуноферментный анализ (ИФА) по механизму реакции близок к РИФ (выявляются те же антитела). Реакцию иммуноферментного исследования относят к иммунологическим реакциям, основанным на высокоспецифическом взаимодействии антигенов бледной трепонемы с антителами больного сифилисом.

В сифилидологической практике используется в основном непрямой вариант ИФА. Принцип наиболее часто используемого непрямого варианта реакции состоит в следующем. На поверхности лунок полистиролового планшета фиксируются иммунные комплексы, образующиеся при взаимодействии антител больного сифилисом с антигенами бледной трепонемы. После этого их выявляют их в цветной реакции с помощью специфических коньюгатов и соответствующих субстратно-хромогенных добавок.

Порядок выполнения теста следующий: на твердофазный носитель с присоединенным к нему антигеном помещается сыворотка больного. При наличии в ней антител, на поверхности носителя образуется комплекс антиген-антитело. Для «проявления» результатов реакции используются антивидовые антитела к Ig человека, конъюгированные с ферментными маркерами. В случае положительной реакции фермент, присоединившийся к комплексу антиген-антитело, разлагает добавленный в систему субстрат, в результате чего развивается цветное окрашивание разной интенсивности.

В реакции определения комплекса сорбированных на твердой фазе АГ и АТ проводят с помощью антиглобулиновых антител, меченных ферментом, по цветной реакции фермента с субстратом.

В реакции определение комплекса сорбированных на твердой фазе антигенов и антител проводят с помощью антиглобулиновых антител, меченных ферментом.

ИФА представляет возможность выявления сывороточных Ig разных классов. На рынке представлены системы, позволяющие определять раздельно IgM и IgG и суммарные антитела.

Специфические антигены, применяемые для ИФА, могут иметь различное происхождение:

ультраозвученные - их получают при результате разрушения бактериальной клетки T.pallidum ультразвуком или иным методом;

рекомбинантные - их получают генно-инженерными технологиями путем внедрения в геном бактериальной клетки (например, кишечной палочки E.Coli) гена, ответственного за синтез определенного антигена T.pallidum, с последующим наращиванием бактериальной массы продуцирующего микроорганизма, разрушением этих клеток, выделением и очисткой антигена;

пептидные - получают в результате последовательного химического синтеза антигенных эпитопов белков T.pallidum.

Организм способен образовать антитела почти к любой части молекулы антигена. При нормальном иммунном ответе этого обычно не происходит. Один или несколько иммуногенных пептидов, выделенных из белкового антигена обладают особой антигенностью, и большинство антител образуется именно к ним. На них развивается наиболее интенсивный иммунный ответ. Наибольшую информативность в ИФА показали иммунодоминантные участки белков бледной трепонемы с молекулярной массой 15 кД, 17кД и 47кД. В качестве антигена использовали детергентный экстракт, или соникат патогенных трепонем штамма Никольс.

3. Способ проведения исследований методом

Принцип метода заключается в выявлении сорбированного на твердой фазе (поверхность лунок пластикового планшета) специфического комплекса антиген-антитело антиглобулиновыми антителами, меченными ферментом (пероксидазой), с помощью цветной реакции с субстратом, учитываемой количественно спектрофотометрически.

Антигены, применяемые для сенсибилизации лунок полистиролового планшета могут быть:

• лизатными - полученными в результате разрушения ультразвуком бледной трепонемы;
• пептидными - полученными в результате химического синтеза фрагментов белков бледной трепонемы и имеющими антигенную реактивность, аналогичную исходным белкам возбудителя;
• рекомбинантными - полученными с помощью методов генной инженерии, несущими антигенные детерминанты, идентичные бледной трепонеме.

В сифилидологической практике обычно используется непрямой вариант ИФА.

4. Учет результатов

При ИФА для визуализации реакции антиген-антитело используют реакцию фермента (щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена) с субстратом, который при этом меняет свою окраску. Интенсивность окраски определяет позитивность реакции (от «–» до «++++»). Результаты ИФА могут оцениваться визуально по 4-бальной системе или инструментально в виде цифровых показателей оптической плотности, получаемых на специальных ридерах (типа Мультискан) при длине волны 492 нм. Т.к. оценка результатов проводится спектрофотометрически, это исключает субъективную интерпретацию.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Сроки позитивации ИФА - с 4-ей недели от заражения. Результаты ИФА (как и РИФ) становятся положительными в первые дни первичного периода или в конце инкубации и остаются положительными во всех периодах. ИФА особенно ценен в ранней диагностике сифилиса – положительные результаты выявления антител могут быть получены уже в конце инкубационного периода заболевания (т. е. на 4–6-й неделе после инфицирования).

6. Чувствительность и специфичность

ИФА – высокочувствительный и специфичный тест, что является его преимуществом. ИФА по механизму реакции, чувствительности и специфичности близок к РИФ, т.к. в обеих реакциях принимают участие одни и те же антитела. Большинство исследователей отмечают высокую специфичность и чувствительность на всех стадиях болезни. Чувствительность различных вариантов ИФА, по данным Г. А. Дмитриева, достигает 98–100 %, а специфичность - 96–100 %. По данным ЦНИКВИ, чувствительность ИФА при сифилисе составляет 99,1% (Приказ № 87 М3 РФ).

Вариант твердофазного ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) относится к самым чувствительным серологическим реакциям, позволяя выявлять 0,0005 мкг/мл антител и 0,000005 мкг/мл антигенов.

7. Область применения метода

Метод рекомендуется использовать при обследовании беременных, контактных лиц, доноров и представителей групп риска. ИФА может применяться как в качестве скринингового, так и подтверждающего теста. За относительно короткое время своей истории, ИФА превратился из ориентировочного теста в подтверждающий. В диагностике сифилиса тест используется также как подтверждающий для образцов, демонстрирующих положительные результаты при использовании различных нетрепонемных тестов и РПГА.

Метод ИФА может быть использован в количественном варианте с расчетом индекса позитивности, или реактивности, который позволяет оценивать уровень антител в образце.

В настоящее время в России применение иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса регламентировано Приказом Минздрава РФ №87 от 26 марта 2001 года «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (приложение №1 «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис»). В приказе планируется замена РСК в комплексе серореакций (КСР) на ИФА и РПГА.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Иммуноферментный анализ является сложным многоступенчатым исследованием, при котором необходимо строго соблюдать все рекомендации производителей диагностических наборов, правила регулировки и настройки применяемой в исследовании аппаратуры.

Источником ошибок при постановке ИФА могут являться следующие моменты:

Исследование в реакции гиперлипидемичной, гемолизированной сыворотки крови или образцов с признаками бактериального пророста;

Не практиковать двух- и более кратного замораживания образца биологического матери¬ала, при необходимости повторного исследования использовать сыворотку из пробирки-дубликата;

Нарушение сроков и условий хранения иммуносорбента и отмывающего раствора; использование тест-наборов с истекшим сроком годности;

Применение компонентов реакции из других диагностических наборов;

Нарушение времени проведения этапов реакции;

Высыхание лунок иммунологического планшета на этапах реакции;

Повторное использование пластиковой посуды (пластиковых лоточков) для приготовления смеси хромогена и субстрата;

Несоблюдение периодичности метрологического контроля параметров работы применяемых аппаратов (вошера и спектрофотометра);

Использование при постановке реакций загрязненной лабораторной посуды: колб, мерных цилиндров, пробирок, пипеток, наконечников пипеточных дозаторов;

Недостаточная тщательность выполнения разведений образцов биологического материала;

Ошибки при внесении образца биологического материала в соответствующую лунку планшета;

Ошибки при перенесении результатов исследования в журнал регистрации, протокол исследования или бланк ответа.

Тщательное выполнение рекомендаций инструкций по применению диагностических тест-наборов, регулярная поверка точности пипеточных дозаторов и автоматических приборов, применение внутреннего положительного и отрицательного контролей позволяют получать результаты ИФА-исследования с высокой воспроизводимостью.

9. Особенности, преимущества и недостатки

ИФА относится к современным, перспективным методам серодиагностики сифилиса ввиду его простоты, воспроизводимости, доступности. Определение антител методом ИФА является идеальным способом диагностики, подходящим для одновременного исследования большого числа образцов. Благодаря своим преимуществам, он завоевал популярность во всех странах.

Технология ИФА-исследования предусматривает соблюдение всех рекомендаций производителей коммерческих диагностических тест-наборов и тщательности выполнения процедуры исследования. Для проведения исследований в ИФА необходимо приобретение дополнительного специального оборудования. Методика постановки занимает более длительное время по сравнению с РМП, RPR и РПГА.

Наличие автоматизации ряда этапов или всего процесса в целом позволяет одновременно исследовать большое количество образцов биологического материала при высокой степени стандартизации исследования, минимизации субъективного элемента в оценке результатов, возможности хранения фиксированных протоколов исследования, что позволяет архивировать данные исследования и обращаться к ним повторно для ретроспективного анализа.

Достоинства:

• Дает возможность дифференцированного и суммарного определения IgM и IgG антител к возбудителю сифилиса.
• высокая чувствительность и специфичность, приближающиеся к 100%,
• воспроизводимость
• возможности автоматизации

К преимуществам ИФА относят высокую специфичность (96-100%) и чувствительность (98-100%), отмечаемые большинством исследователей.

Наличие автоматизации ряда этапов или всего процесса в целом позволяет одновременно исследовать поток с большим количеством образцов биологического материала при высокой степени стандартизации исследования, минимизации субъективного элемента в оценке результатов, возможности хранения фиксированных протоколов исследования, позволяющих архивировать данные исследования и обращаться к ним повторно для ретроспективного анализа.

Существенными недостатками методик, выполняемых вручную, в т. ч. определения антител к антигенам T. pallidum методом ИФА, являются:

~ возможные ошибки персонала при проведении исследования (оплошность, небрежность, нарушение технологии);

~ невозможность полной стандартизации процесса исследования при ручном варианте постановки ИФА;

~ повышенный риск заражения персонала.

10. Модификации метода

Наряду с классическим непрямым ИФА известен и метод ловушечного ИФА . Он был предложен в 1989 г. O. E. Ijsselmudien и соавт. для выявления антител класса IgM к антигенам Tr. pallidum. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

На поверхности лунок планшета сорбированы очищенные антитела к иммуноглобулинам человека класса M, и после инкубации исследуемой сыворотки все IgM связываются с носителем. Наличие же среди связанных IgM специфичных для антигенов Tr. pallidum выявляется с помощью антигенов Tr. pallidum, конъюгированных с ферментом.

Этот метод позволяет выявлять антитела не только класса IgM, но и классов IgG, IgA. Для этого лунки планшетов сенсибилизируются аффинно очищенными антителами определенного класса против иммуноглобулинов человека. При этом из сыворотки вылавливаются антитела этого класса, а выявление трепонемоспецифических антител осуществляется путем их соединения с конъюгатом, представляющих соединение трепонемного антигена с ферментом.

Использование ловушечного варианта иммуноферментного анализа снижает риск ложноположительных реакций, опосредованных ревматоидным фактором крови, перекрестными реакциями между иммуноглобулинами классов М и G. При обследовании новорожденных в этом случае также исключаются ложноположительные результаты анализа, связанные с выявлением IgM, направленных против материнских антитрепонемных IgG.

В качестве вариантов ИФА за рубежом нашли широкое применение enzyme immune assay (EIA) и система ICE Syphilis . В последней в ячейках планшета сорбирована смесь антител к IgM и IgG, а также трех рекомбинантных белков T. pallidum. Положительные результаты тестируются в этой же тест-системе в двух повторах для выдачи окончательного результата.

В России был разработан ряд тест-систем для серодиагностики сифилиса методом ИФА с отечественными реагентами. Эти системы обладают высокой специфичностью и чувствительностью.

Помимо вышеперечисленных, существуют также другие варианты ИФА, в том числе допускающие прямое выявление возбудителя в крови (прямой ИФА), дот-ИФА с постановкой реакции на полосках нитроцеллюлозы, ИФА с капиллярной кровью, а также иммуноблоттинг, или Western Blot, с одновременным выявлением АТ к различным компонентам возбудителя.

Современной улучшенной модификацией ИФА является иммуноблоттинг.

ИХА (иммунохемилюминесцентный анализ), ИХЛ (иммунохемилюминесценция)

С развитием лабораторной диагностики в условиях модернизации здравоохранения РФ в практику лабораторий вошла автоматизация лабораторных исследований, которая позволяет стандартизовать аналитические этапы исследований. Это способствует повышению качества диагностики. С внедрением автоматизации стали применяться новые высокотехнологичные методы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, такие как иммунохемилюминесцентный анализ (ИХА) (chemiluminescence immunoassay - CLIA)

Хемилюминесценция - процесс излучения фотонов при переходе электронно-возбужденных продуктов окислительных химических реакций в исходное энергетическое состояние. В ходе реакции хемилюминесценции выделяется значительное количество энергии, и квантовый выход излучаемого света достаточно высок. Из всех неизотопных методов хемилюминесценция обеспечивает наиболее высокую чувствительность. Для иммунометрических методов чувствительность хемилюминесценции на порядки превосходит чувствительность радиоиммуноанализа.

Метод иммунохемилюминесценции (ИХЛ) в настоящее время нашел свое применение при диагностике маркеров опухолей, аутоиммунных заболеваний, диабета, кардиомаркеров, гормонов (щитовидной железы, надпочечников, женских и мужских половых гормонов), torch-инфекций, вирусных гепатитов, вирусов группы герпеса.

На основе метода иммунохемилюминесценции разработан ряд высокочувствительных и специфичных (98-100%) тест-систем для диагностики сифилиса, применяемых в основном за рубежом.

В методе в качестве антигенов используются полученные генно-инженерными методами рекомбинантные липопротеины, которые являются полными аналогами антигенов T.pallidum.

Метод ИХА по результатам клинического исследования получил признание и рекомендован к применению в лабораторной диагностике сифилиса в Российской Федерации в качестве скринингового и подтверждающего теста при наличии в лабораториях соответствующего оборудования. В 2012 г. ИХА был включен в качестве скринингового и подтверждающего теста для диагностики сифилиса в Клинические рекомендации по ведению больных с инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенитальными инфекциями

Таким образом, использование высокотехнологичного ИХА, вошедшего в практику как мировой, так и отечественной лабораторной диагностики с внедрением автоматизации, обеспечивает следующие преимущества:

• исключение влияния субъективных факторов на аналитическом этапе исследования
• безопасность персонала при выполнении исследований потенциально инфицированного биологического материала
• повышение скорости получения результатов пациентом
• стандартизацию исследований и контроль качества исследования
• выдачу надежных достоверных результатов пациентам
• высокое качество клинических лабораторных исследований.

По чувствительности метод ИХА сопоставим с методом радиоиммунного анализа, а по простоте исполнения, безопасности для персонала и многим другим параметрам – превосходит его.

Метод ИХА, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (98–100%), дает возможность количественного определения уровня антител к возбудителю сифилиса, может быть использован для подтверждения сифилитической инфекции и скрининга. Ограничения применения: не может быть использован для контроля эффективности терапии, может давать ложноположительный результат.

Иммунохроматография (ИХГ).

Относительно новыми для использования в Российской Федерации являются методы выявления трепонемоспецифических антител, основанные на методах иммунохроматографии (ИХГ). Как и в методе ИХА, в качестве антигенов используются рекомбинантные липопротеины, полученные генно-инженерными методами (например: антигены Tp15, Tp17, Tp47) и биосинтетический пептид TmрА. Перечисленные антигены также используются в разных сочетаниях в составе иммуносорбентов в ИФА и иммуноблоттинге.

Метод ИХГ позволяет быстро определять содержание трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяется при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям.

Ограничения применения: не может быть использован для контроля эффективности терапии,может давать ложноположительный результат.

ПБТ (простые быстрые тесты у постели больного)

Относительно недавно в серодиагностике сифилиса начало развиваться направление по разработке так называемых простых быстрых тестов (ПБТ), или тестов у постели больного (Point-of-care - РОС). Простые быстрые тесты у постели больного, или иммунохроматографические тесты позволяют проводить быстрое определение содержания трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяться при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям. Ограничения применения: не могут быть использованы для контроля эффективности терапии, могут давать ложноположительный результат.

Эти тесты основаны на иммунохроматографическом определении антител к трепонемным антигенам бледной трепонемы я выполняются на стрипах; при этом можно использовать как цельную кровь, так и сыворотку (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Формат тестов позволяет проводить исследования при отсутствии специального оборудования и без использования электричества. Однако ввиду относительно невысокой чувствительности и специфичности эти тесты пока не находят своего широкого применения в практике.

Иммуноблотинг (Western Blot)

В последние годы появились методы исследования, направленные на обнаружение и анализ содержания антител к каждому антигену бледной трепонемы раздельно. Один из таких методов - это метод иммунного блота (или блоттинга, имммуноблотинга, Western blot), который применяют для определения IgG- либо IgM-антител к бледной трепонеме. Метод иммуноблоттинга является модификацией иммуноферментного анализа - вариантом ИФА.

Имммуноблотинг является одним из самых современных методов серодиагностики сифилиса и активно используется за рубежом. Свое название ("западный блоттинг") он получил в качестве юмористического ответа на названия техник определения ДНК ("южный блоттинг") и РНК ("северный блоттинг").

1. История метода

Иммуноблоттинг (Western blot) используют для определения IgG- либо IgM-антител к антигенам бледной трепонемы (Herremans М. et al., 2007).

2. Классический иммуноблот

Классический иммуноблот (Western Blot Analysis) сочетает в себе иммуноферментный анализ и применение электрофоретического метода. Белки-антигены возбудителя сифилиса предварительно разделяют методом электрофореза и переносят на носитель - нитроцеллюлозную мембрану (стрип). Этот перенос и называется блоттингом. Затем этот носитель с разделенными точками (blots), обрабатывают исследуемой сывороткой и антителами к IgG или IgM, меченными ферментами либо радиоактивными веществами. Метод предполагает использование природных или рекомбинантных белков трепонемы.

Электрофорез - это разделение заряженных соединений на основе их подвижности в электрофоретическом поле. При наложении разности потенциалов в какой-то среде положительно заряженные молекулы движутся к отрицательно заряженному электроду, а отрицательно заряженные - к положительному электроду.

Большинство глобулярных белков собраны таким образом, что большая часть заряженных групп, а именно гидрофильных, расположена на поверхности белка, тогда как незаряженные, гидрофобные остатки погружены во внутрь глобулы. В электрическом поле в соответствии со своим зарядом белки мигрируют по направлению к противоположно заряженному электроду.

Электрофоретическое разделение белков производят в синтетический гелевой среде на основе полиакриламида. Для разделения белков в соответствии с их молекулярной массой перед началом электрофореза белковую смесь преинкубируют в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

Детальные исследования зарубежных ученых Weber и Osborn (1969) показали, что после такой обработки единственным фактором, который может повлиять на подвижность белков в полиакриламидном геле (ПААГ) является размер белка, а точнее его молекулярная масса. Это позволило применить метод электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН для достаточно точного определения молекулярной массы белков и пептидов. В зарубежной литературе этот метод был назван SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis).

Профиль реактивности в классическом WB-тесте с природными антигенами (метод электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). (1) - контрольный положительный результат, (2) - контрольный отрицательный результат, (3-6) - клинические образцы.

В тестах на сифилис с помощью данного метода, предварительно очищенная и разрушенная до составных компонентов бледная трепонема подвергается электрофорезу в полиакриламидном или агарозном геле. При этом входящие в ее состав антигены разделяются по молекулярной массе.

Затем методом вертикального электрофореза антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый глазом спектр антигенных полос, характерный для бледной трепонемы.

При проведении анализа на нитроцеллюлозную полоску (стрип) наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и др.). Если в пробе есть специфические антитела, то в процессе инкубации они прочно связываются со строго соответствующими (комплементарными) им антигенными полосами и образуют комплекс “антиген – антитело”.

После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов во время отмывания стрипа следует инкубация с конъюгатом – меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (антитела к IgG или IgM человека), в ходе которой на поверхности мембраны происходит присоединение к имеющимся комплексам “антиген – антитело” антител, меченных ферментом.

После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция – окрашивание участков мембраны (в виде полос), где располагаются отдельные антигены бледной трепонемы, антитела к которым находились в исследуемой сыворотке. Интенсивность окрашивания зависит от количества связавшихся антител из сыворотки. Результат реакции оценивается визуально.

Наличие полос на определенных участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам бледной трепонемы.

Определяемые с помощью этого метода иммунодетерминанты 15, 5, 17, 44,5, 47 кД обладают диагностической значимостью при сифилисе. Ig G-иммуноблоттинг по чувствительности и специфичности подобен РИФ с абсорбцией (РИФ abs). Ig М-иммуноблоттинг может служить диагностическим тестом для врожденного сифилиса.

3. Иммуноблот в формате линейного иммунного анализа

Линейный иммунологический анализ (line immunoassay, LIA) позволяет одновременно определять антитела к антигенам бледной трепонемы в сыворотке или плазме крови человека. Антигены заранее нанесены на тест-полоски (стрипы), которые поставляются в составе коммерческих диагностических наборов.

Стрипы изготавливаются из нитроцеллюлозной мембраны, полиамидной с пластиковой подложкой или нейлоновой мембраны с пластиковой основой. При изготовлении, на тест-полоску помещают несколько дискретных антигенов в виде отдельных антигенных линий. Помимо этих антигенов сифилиса, на каждую полосу наносятся еще четыре контрольных линии: стрептавидин и контрольные пробы (3 + , 1 + и ± линия среза).

Для полосок используются искусственные антигены, полученные генно-инженерными способами - рекомбинантные белки или синтетические полипептидные конструкции. Это аналоги поверхностных антигенов бледной трепонемы - TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA с молекулярной массой 15, 17, 47 kDа и 44,5 (ТmpА), где kDа=kiloDaltons. С их помощью определяют сывороточные антитела к различным иммунодоминантным компонентам возбудителя.

Инкубация испытательного образца проходит в кювете, куда также помещается индикаторная полоса. Антитела к T. рallidum определяются по связыванию с антигенами, нанесенными на тест-полоски. Если в образце имеются специфичные для T. pallidum антитела, они образуют связи с отдельными линиями антигенов. При взаимодействии антител, содержащихся в испытуемой сыворотке, с дискретными антигенами Т. pallidum, помещенными тест-полоску, образуется комплекс антиген-антитело в виде визуально определяемых цветных полос.

При учете результатов иммуноблотинга оценивают реактивность сыворотки к каждому из антигенов в отдельности. Суммарный положительный ответ выдается при получении результата одновременно с двумя или тремя из представленных антигенов.

Исследовательские процедуры проводятся вручную или на специальном анализаторе, с интерпретацией результатов с помощью специализированной компьютерной программы для инфекционных заболеваний.

За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса, метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

4. Учет результатов

Для считывания интенсивности окрашивания антигенных полос на стрипах разработаны фотометры, работа которых основана на отражении сигнала, что исключает субъективную оценку и дает потенциальную возможность автоматизации.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Тесты, использующие метод иммуноблоттинга, могут определять специфические антитела к антигенам бледной трепонемы на очень ранней стадии заболевания. Наиболее значимыми в диагностике сифилиса являются антитела к антигенам бледной трепонемы TpN15, TpN17, TmpA и TpN47. Эти антигены - мембранные белки, имеющие молекулярную массу 15, 17, 44,5 и 47 кДа соответственно.

При внедрении в организм человека бледной трепонемы, противосифилитические антитела появляются в таком порядке: сначала развивается иммунный ответ к антигенам TpN17, затем к TpN47, после TpN15 и позже всех TmpA. При учете результатов теста оценивают реактивность сыворотки к каждому из них в отдельности. Например, когда в линейном блоте имеется реактивность только к антигенной линии TpN17 и TpN47, это означает, что болезнь в начальной стадии. Чем больше антигенных линий становятся реактивными, тем дальше развивается инфекция. При лечении сифилиса картина реактивности в этом тесте меняется.

Определение IgM к протеинам с молекулярной массой 15,17, 41, 47 кДа позволяют выявить 29,2% больных при вторичном сифилисе, 12,5% – при раннем скрытом сифилисе и 8,0% – при серорезистентности. Поиск IgG к тем же молекулам характеризуется чувствительностью 61,6% при серорезистентности и 100% при вторичном и раннем скрытом сифилисе.

6. Чувствительность и специфичность

Согласно данным литературы, чувствительность и специфичность теста очень высокие - 99,6-100 и 99,3-99,5 % соответственно. В классическом методе это достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичности детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях с помощью иммуноблоттинга можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме.

Чувствительность линейного блота также составляет 99.6%, а специфичность находится в диапазоне между 99.3% и 99.5%.

По оценке специалистов иммуноблоттинг с рекомбинантными высокоспецифичными антигенами по чувствительности и специфичности аналогичен РИФ-абс.

Согласно данным зарубежной литературы и результатам изучения в ЦНИКВИ, метод иммуноблоттинга обладает при диагностике сифилиса высокой чувствительностью (98,8-100%) и специфичностью (97,1-100%).

7. Область применения метода

Иммуноблотинг (иммуноблот) является высокоспецифичным и высокочувствительным референтным методом. Высокие чувствительность и специфичность позволяют рассматривать этот метод как подтверждающий тест на сифилис. Метод может применяться для подтверждения диагноза, а также в случае, если другие трепонемные тесты дают сомнительные и противоречивые результаты. С помощью иммуноблоттинга можно подтвердить диагноз у пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в том числе и при помощи РПГА или ИФА.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Ложноположительные результаты очень редки. Ложноотрицательные результаты бывают также достаточно редко и наблюдаются у больных с иммунодефицитами – чаще у ВИЧ- инфицированных и при эффекте диагностического «окна» из-за задержки синтеза антител, а также при ошибках на этапе постановки.

Использование современных тест-систем диктует точное соблюдение всех требований, предъявляемых как к материалу, так и к выполнению постановки реакции. В основном, источник ошибок - нарушение порядка и технологии проведения исследования (особенно для классического вестерн-блота), несоблюдение рекомендаций производителей тест-наборов. . Ошибки могут быть также допущены при сборе, доставке, хранении проб сыворотки крови, а также при выполнении тестов. Помимо испорченных образцов, среди других возможных причин - использование тест-наборов с истекшим сроком годности, а также ошибки при анализе результатов исследования.

9. Особенности, преимущества и недостатки

Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности результатов.

Тест не требует высокоочищенных антигенов, референтных и контрольных сывороток. Идентификация мишени антител основана на молекулярном весе белка, с которым реагируют антитела из сыворотки пациента. В одной реакции может быть обнаружено связывание антител с несколькими антигенами, каждый из которых может быть точно охарактеризован. За счет этого иммуноблоттинг обладает рядом преимуществ перед другими методами выявления антител, результаты которых зависят от стандартизации, чувствительности, качества субстрата, нестабильности или нерастворимости определенных антигенов

Метод легко воспроизводим, относительно прост в исполнении и интерпретации результатов, дает возможность определять спектр антител сразу к нескольким антигенам Т. pallidum и оценивать вклад в общую реакцию антител различной специфичности.

Применение высокоочищенных рекомбинантных и пептидных антигенов снижает до минимума неспецифическую реактивность сывороток. Использование метода дает возможность отказа от трудоемких и субъективных методов, представляющих опасность для исследователя (перевивка штаммов Г. pallidum, работа с патогенной Т. pallidum при постановке реакции). Это определяет предпочтение метода иммуноблоттинга перед другими трепонемными тестами (РИФ и в особенности РИБТ) для диагностики сифилиса.

10. Модификации метода

Существует несколько коммерческих тест-систем на основе данного метода. Одни из них выполнены в формате вестерн-блота , состоят из стрипов, на которые перенесены белковые компоненты T. pallidum, предварительно разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле.

Другие выполнены в формате линейного блота , состоят из стрипов, на которых в виде дискретных линий сорбированы рекомбинантные и синтетические полипептиды - аналоги поверхностных антигенов T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.

Результаты вестерн-блота труднее интерпретировать, так как на стрипах выявляется большое разнообразие антител, многие из которых являются группоспецифическими. Напротив, интерпретация результатов линейного блота не вызывает затруднений; кроме того, дополнительные контрольные линии, нанесенные на стрип, позволяют проводить полуколичественную оценку уровня антител к четырем антигенам T. pallidum.

xMAP-технология

хМАР - современная технология, позволяющая проводить многопараметрические исследования путем одновременной детекции множества аналитов в одном биологическом образце. В качестве твердой фазы используются окрашенные микросферы, покрытые захватывающими реагентами (олигонуклеотидами, антителами, антигенами).

Исследуемый образец добавляется к раствору, в котором содержатся микросферы. Выявляемые в образце аналиты связываются с соответствующей микросферой, после чего в раствор вносится детектирующий агент (детектирующие антитела, флюоресцентная метка). Для детекции определяемого аналита используется система двух лазеров, позволяющих проводить как качественную оценку наличия аналита в пробе (для этого используется красный лазер, классифицирующий микросферы по цвету), так и количественную оценку содержания аналита в пробе (для этого используется зеленый лазер).

Исследование осуществляется в автоматическом режиме на анализаторах типа Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) снабженных программным обеспечением.

Ппроизводительность xMAP-технологии значительно превышает показатели классического твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) при существенно меньшем объеме биоматериала.

хМАР-технология, обладающая высокой аналитической чувствительностью, в настоящее время используется для решения широкого круга клинических задач. С ее помощью в одном образце биологического материала осуществляется одновременная детекция известных онкомаркеров, кардиомаркеров, маркеров острой фазы и сахарного диабета, широкого спектра цитокинов, хемокинов, факторов роста. Одномоментное выявление множества аналитов в одном биологическом образце позволяет существенно сократить время обследования пациента. К настоящему времени разработан ряд тест-систем для выявления антител к возбудителям ИППП, в частности сифилитической инфекции, методом хМАР.

РПГА является одним из самых значимых анализов крови. Он позволяет выявить сифилис на любых стадиях, а также ряд других заболеваний. Этот анализ считается одним из самых точных методов выявления возбудителей сифилиса. В каких случаях пациента могут отправить на обследование и что значат результаты?

Что такое РПГА

РПГА является реакцией пассивной гемагглютинации, а если точнее - анализом для выявления этого процесса. В ходе исследования легко можно обнаружить антигены бледной трепонемы, именно этот микроорганизм провоцирует сифилис. Если человек полностью здоров, бледная трепонема, попав в организм, провоцирует ответную реакцию со стороны иммунной системы - выработку особых антител. По их наличию и определяется, есть заболевание или нет.

Все лабораторные исследования на сифилис делятся на два типа:

• специфические;
• неспецифические.

Всё зависит от того, какие именно антитела присутствуют в крови. РПГА относят к специфическому типу анализа для выявления возбудителей сифилиса. Впервые такие исследования стали проводить в 1965 году, РПГА оказался настолько точным анализом, что быстро стал наиболее популярным среди остальных методик диагностики сифилиса. Исследование позволяет выявить болезнь на любой стадии, включая латентную.

Однако в некоторых случаях РПГА может дать ложную положительную реакцию. Это может случиться из-за наличия некоторых вирусных заболеваний или при сниженном иммунитете после какой-либо болезни.

Насколько анализ достоверен?

Если человек заразился сифилисом, выявить болезнь можно не ранее чем через 2-4 недели - только на этом сроке начинают вырабатываться антитела к возбудителю. Иногда инкубационный период может длиться более месяца. РПГА, анализ крови, при ранней диагностике имеет точность 86%. Начальная стадия заболевания самая «неуловимая» для этого типа исследования. А вот на следующих стадиях сифилиса и у носителей латентного вируса, точность диагностики повышается до 99-100%.

Это позволяет применять РПГА как дополнительное исследование для подтверждения уже имеющегося диагноза или при положительных результатах других анализов (нетрепонемного типа). РПГА всё чаще используют для скрининга, но при положительных результатах так или иначе проводят ещё одно специфическое исследование.

Кто в зоне риска

Для проведения РПГА требуется направление от врача. Направить пациента на анализ могут в нескольких случаях:

1. Если имеются видимые признаки болезни. Сюда относятся язвы на коже, увеличенные лимфоузлы, частичное облысение волосяного покрова и пр.
2. Если у пациента был прямой контакт с больными сифилисом, для профилактики ему также необходимо пройти обследование.
3. Все доноры, сдающие кровь, обязаны проверяться на сифилис перед процедурой.
4. Для оформления санитарной книжки или ежегодных профосмотров на предприятиях также потребуется пройти необходимые обследования.
5. Если скрининг дал положительный результат.
6. На сифилис проверяют каждого, кого готовят к госпитализации в стационар.
7. Обследование пациента перед любой операцией также требует прохождения обследования.

Врач может назначить РПГА не только при подозрении на сифилис или для планового осмотра, но и для диагностики следующих заболеваний:

• дифтерии;
• дизентерии;
• сальмонеллеза.

Как проводится анализ

Для проведения РПГА берётся кровь из вены, полученный образец отправляют на исследование. Чтобы результаты были максимально точны и не искажены, важно правильно подготовиться к процедуре. Чтобы не пришлось сдавать кровь заново, необходимо руководствоваться следующими правилами перед визитом к специалисту:

1. Кровь сдаётся ранним утром до 8-10 часов.
2. Нельзя завтракать, пить чай или кофе, допустимо только употребление небольшого количества воды. Желательно, чтобы последний приём пищи был за 10-12 часов до анализа.
3. Хотя бы за полчаса до обследования нельзя курить, но лучше всего сделать перерыв между сигаретами в 4-6 часов.
4. В день анализа и минимум за сутки до него нельзя пить алкогольные напитки любой крепости.
5. Если есть необходимость по графику принимать лекарства, об этом обязательно нужно сказать врачу, если нет возможности немного перенести это по времен.
6. При плохом самочувствии или слабости нужно обязательно предупредить медсестру, которая забирает кровь для анализа, или врача.

Кровь из вены на РПГА

К подготовке важно относиться ответственно, поскольку от результатов анализа зависит многое, в особенности точная постановка диагноза.

Ошибки в диагностике и назначение неверного лечения могут привести к плачевным последствиям.

Когда ждать результатов

Чтобы РПГА анализ дал наконец положительную или отрицательную реакцию на сифилис, должно пройти определённое время. Положительная реакция может проявиться через месяц после заражения, однако на первичной стадии показатели титров одни из самых низких - менее 1:320. На вторичной стадии показатели увеличиваются, а вот при латентном сифилисе анализы будут такими же, как и в самом начале развития заболевания.

Когда точно определена стадия сифилиса, назначается лечение в виде курса препаратов. Но даже после излечения от заболевания, анализы РПГА могут давать положительные результаты на сифилис. Это случается в большинстве случаев, положительный анализ у людей, вылечившихся от сифилиса, может быть в течение всей оставшейся жизни.

Есть случаи, когда положительные реакции на сифилис вызваны совершенно иными причинами. Такие результаты анализа называют ложноположительными, чаще всего такие реакции бывают:

• у беременных;
• во время менструации;
• если недавно была вакцинация;
• если был инфаркт миокарда незадолго до обследования;
• при инфекционных заболеваниях (оспа, грипп, ОРВИ, ВИЧ, гепатит (вирусный) и пр.);
• при онкологии;
• при ослаблении иммунитета;
• у больных с патологиями внутренних органов.

Исследование РПГА для диагностики других инфекций

Реакция РПГА позволяет выявить не только сифилис, но и ряд других инфекционных заболеваний. Сдавать кровь понадобится, например, людям с подозрениями на острую кишечную инфекцию (сальмонеллез).

Болезнь провоцируют сальмонеллы, попадающие в организм человека. По мере развития сальмонеллеза постепенно разрушается структура ЖКТ, а также происходит сильная интоксикация. Основными симптомами кишечной инфекцией являются:

• рвота;
• диарея;
• изменение запаха стула, а также появление в нём слизи или кровавых выделений;
• боль в животе;
• высокая температура;
• озноб;
• плохое самочувствие;
• обезвоживание и пр.

Ещё одним заболеванием, для выявления которого можно применять РПГА, является корь. Она характеризуется поражениями слизистых глаза, ротовой полости и дыхательных путей. Кроме этого явными признаками болезни является сыпь на всём теле пациента, а также сильная интоксикация. Последняя сопровождается рвотой, нарушениями стула, нарушением водного баланса в организме и пр.

Исследование РПГА также может выявить столбняк, который является острой инфекцией.

Возбудитель этого заболевания легко проникает в организм через царапины, раны, порезы, ожоги и пр. Также можно заразиться столбняком, если в больницах или при косметических процедурах использовались нестерильные инструменты и материалы. Главными симптомами, по которым можно выявить столбняк, являются:

• тонус мышц;
• слабость;
• раздражительность;
• плохой аппетит;
• апатия;
• судороги в мышцах лица;
• если столбняк следствие травмы, может ощущаться тянущая вокруг повреждённого участка тела;
• затрудняется глотание воды и пищи.

Исследование РПГА также применяется для выявления коклюша на любой стадии. Это очень важно, поскольку на начальной стадии заболевания нет чётких симптомов, позволяющих его диагностировать. Подозрения на инфекцию чаще всего появляются уже на более поздних стадиях.

При коклюше может быть повышенная температура, однако точно так же она может оставаться в пределах нормы и не превышать стандартные 36,6. Позже у больного появляется кашель, приступы которого постепенно становятся всё чаще и сильнее.

Итак, реакция пассивной гемагглютинации является крайне эффективным методом диагностики сифилиса. Несмотря на то, что чаще всего РПГА используют для выявления антител бледной трепонемы, с помощью этого анализа можно установить наличие и других инфекций - кори, коклюша, сальмонеллеза и пр. Чтобы результаты исследования были максимально чёткими, важно правильно к ним готовиться и соблюдать все необходимые условия.

Возможно, Вам дали направление в лабораторию на анализ РПГА, но Вы не очень понимаете, что означает эта аббревиатура. Что это такое и насколько все серьезно Вы подробно узнаете из данной статьи.

Помимо пациентов с выраженными симптомами венерических заболеваний, направление на РПГА анализ могут дать людям, проходящим медицинское обследование с целью устройства на работу, перед проведением хирургической операции, или при становлении женщины на учет по беременности. Здесь нет ничего страшного и зазорного, просто, таким образом, специалисты анализируют население на предмет серьезных половых заболеваний, что позволяет своевременно выявить носителей инфекции и оказать им должную медицинскую помощь еще до развития осложнений.

Если Вы практикуете незащищенный секс (независимо от того, как хорошо Вы знакомы с сексуальным партнером, ведь многие люди сами не подозревают о своем заражении), либо подозреваете своего постоянного партнера, Вы можете спокойно сдать кровь и в скором времени узнать результат и развеять страх от неизвестности. Чтобы получить направление на лабораторный анализ не обязательно идти к венерологу. Достаточно обратиться с этой просьбой к своему терапевту, либо рассказать о беспокоящих подозрениях гинекологу или урологу.

Расшифровка анализа

РПГА расшифровывается, как реакция пассивной гемагглютинации. Знать ее значение необходимо при определении наличия возбудителя тяжелого венерического заболевания - сифилиса. Если человеческий организм поддался заражению, по результатам анализа крови это можно точно выявить.

В ходе исследования специалист может обнаружить агглютинацию эритроцитов, означающую, что красные кровяные клетки начали склеиваться между собой и выпадать в осадок под каким-то негативным воздействием. В данном случае это бледная трепонема, обитающая на верхних слоях, и провоцирующая поражение организма сифилисом.

Механизм заражения достаточно прост:

1. Есть здоровый организм;
2. В него попадает патогенный микроорганизм - бледная трепонема;
3. Развивается иммунный ответ;
4. Это в свою очередь провоцирует выработку антител, которые и являются признаком имеющейся венерической болезни.

Для анализа крови на РПГА характерно два вида антител, указывающих на наличие или отсутствие возбудителя сифилиса:

• Неспецифический и нетрепонемный;
• Специфический и трепонемный.

Данная методика исследования была впервые применена в 1965-ом году. С тех пор она активно используется для диагностики сифилиса. Ее высокая чувствительность позволяет не только обнаружить патоген, но и определить стадию, на которой протекает заболевание.

Известно четыре формы поражения сифилисом:

1. Первичная;
2. Вторичная;
3. Третичная;
4. Латентная.

При развивающихся аутоиммунных патологиях, на фоне некоторых вирусных заболеваний, в организме больного может возрасти количество неспецифических антител, которые воспримутся анализом РПГА, как ложная реакция.

РПГА анализ крови показан всем пациентам, у которых были жалобы, схожие на признаки сифилиса, либо когда врач подозревает нечто подобное благодаря своему большому практикующему опыту.

Также очень важно проходить подобное обследование некоторым представительницам женского пола, которые планируют в скором времени забеременеть. Потому что в их случае нужно пролечиться, а после только думать о рождение ребенка, если, конечно, им важно его здоровье.

Этот анализ нередко входит в группу обязательных тестов перед оперативным вмешательством. Благодаря полной диагностике организма можно спланировать ход операции, и ее благоприятный исход.

Как сдавать этот анализ

Вы наверное понимаете, насколько серьезный диагноз может быть поставлен по результатам РПГА анализа.

Иногда заключение бывает ошибочным по причине некачественной подготовки пациента к исследованию, отчего ложноположительный ответ становится поводом для назначения бесполезного или наоборот, вредящего лечения.

Чтобы не допустить искажение результатов теста достаточно следовать нижеперечисленным рекомендациям:

• Никакой пищи накануне сдачи крови на РПГА употреблять нельзя. Этот анализ, как и большинство других, производится строго натощак;
• Любые напитки, кроме простой чистой воды также не должны попасть в организм в день, отведенный под анализ. Если будете пить разрешенную жидкость, то ее объем должен быть минимальным, чтобы он никак не повлиял на состав крови;
• Обычно, чтобы человек не морился голодом и жаждой, забор крови происходит в утренние часы;
• В это же утро лучше вовсе не курить. Вещества, содержащиеся в дыму и парах, могут дать негативную реакцию, из-за чего результаты будут неверно расшифрованы лаборантом;
• Запрет возлагается также и на алкоголь. Причем пить спиртное лучше прекратить еще за несколько дней до исследования.

Придя в специальный кабинет, пациент должен оголить свою руку от одежды, чтобы медсестра смогла взять кровь из вены. Процедура эта известна практически всем. Она относительно безболезненна и быстра. По ее окончанию Вам скажут, когда результаты анализа РПГА будут готовы, чтобы их можно было забрать.